一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法

摘要

本发明公开了一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法，包括：获取无菌组培苗、叶片诱导产生不定芽、不定芽的初代培养和继代培养，诱导培养基使用基础培养基NN69、生长素IBA和细胞分裂素TDZ相组合，叶龄20‑50d左右，暗培养21d，雪花梨叶片再生效果显著，再生率可达到70.83％，平均每叶再生芽数为2.06个，愈伤发生率达到100％，褐化率极低甚至为0，足以满足梨品种种质保存的需要和作为遗传转化材料的再生率要求。对叶片要求不高，丰富了材料来源，并解决了木本植物组织再生过程中褐化率高的难题。有效解决了东方梨品种再生率普遍较低的问题，有望为东方梨品种的遗传转化提供一个有效材料，实现梨遗传转化的突破。

主权项

一种高效快速的梨叶片再生出不定芽的方法，其特征在于包括：获取无菌组培苗、诱导产生不定芽、不定芽的初代培养和继代培养；包括以下具体步骤：1)梨无菌组培苗的获取：剪取带芽梨树枝条，置于2％蔗糖溶液中，在温度25‑28℃下催芽；待腋芽萌发后，将枝条剪成茎段，每个茎段带3个芽，流水冲洗；将芽切下，芽消毒后，接种于继代培养基：MS+0.1‑0.3mg/L IBA+1.8‑2.2mg/L 6‑BA+25‑35g/L蔗糖+6‑7g/L琼脂上，培养基pH5.8‑6.0，每隔30‑60d继代培养一次，获得组培苗；2)叶片处理：取当次继代培养20‑50d，平展、健壮、肥厚的保留叶柄的组培苗叶片，垂直于叶片主脉横切2‑3刀，叶片远轴面向下接种于诱导培养基上；所述的诱导培养基为：NN69+1.0‑2.0mg/L TDZ+0.2‑0.5mg/L IBA+25‑35g/L蔗糖+8‑10g/L琼脂，培养基pH为5.8‑6.0；3)叶片暗培养、光培养：将叶片置于避光处暗培养，培养皿倒置，每隔7d换一次培养基，在温度25‑28℃下暗培养14‑21d，再置于光下培养，光周期(昼/夜)14/10h，光照强度2000‑4000lx，温度25‑28℃，培养皿正面放置，每隔10d换一次培养基，不定芽产生后，将带芽叶片置于继代培养基上继续培养，诱导其分化出更多的不定芽；所述的继代培养基为：MS+0.1‑0.3mg/L IBA+1.8‑2.2mg/L 6‑BA+25‑35g/L蔗糖+6‑7g/L琼脂，培养基pH为5.8‑6.0；4)不定芽继代：待不定芽长至0.8‑1.2cm，将芽切下，置于初代培养基中初代培养，20d‑40d后置于继代培养基中继代培养，每隔45d继代一次，获得组培苗；所述的初代培养基：MS+0.1‑0.3mg/L IBA+0.8‑1.2mg/L 6‑BA+25‑35g/L蔗糖+6‑7g/L琼脂，培养基pH为5.8‑6.0；所述的继代培养基：MS+0.1‑0.3mg/L IBA+1.8‑2.2mg/L 6‑BA+25‑35g/L蔗糖+6‑7g/L琼脂，培养基pH为5.8‑6.0。