含N-乙酰化结构肝素寡糖的制备方法

摘要

本发明涉及含N‑乙酰化肝素糖库的制备纯化方法，是以肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素来富集含N‑乙酰化结构寡糖，然后通过Bio‑Gel P10凝胶色谱法制备了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗样品，再利用强阴离子高效液相色谱等方法对粗样品进一步分离，分别提纯到4种六糖和3种八糖片段。应用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解与强阴离子色谱法分析各纯化寡糖的二糖组分，并结合肝素酶Ⅰ底物特异性，初步推断4种六糖和3种八糖的序列结构；最终应用电喷离子阱‑时间飞行质谱（ESI‑IT‑TOF‑MS）鉴定结构。本发明解决了含N‑乙酰化肝素寡糖难制备及结构测定问题，该问题的解决也将使肝素/硫酸类肝素特殊结构和功能之间关系的研究得以进一步开展。

主权项

一种含N‑乙酰化结构肝素寡糖的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）以低分子量肝素为原料，经肝素酶Ⅰ酶解富集含N‑乙酰化结构的寡糖；（2）然后通过Bio‑Gel P‑10凝胶色谱法分离得到系列肝素寡糖粗样品；（3）再利用强阴离子高效液相色谱方法对步骤（2）的粗样品进一步分离，分别提纯得到4种六糖和3种八糖片段；（4）最后利用肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解与强阴离子色谱法分析各纯化寡糖的二糖组分，并结合肝素酶Ⅰ底物特异性，分析4种六糖和3种八糖的序列结构；最后利用质谱法测定寡糖的分子量；所述的步骤（1）具体为：将100～300 mg的低分子量肝素溶解在1~3ml、0.1 M、pH 7.0乙酸钠缓冲溶液中，然后加入30～70mIU肝素酶Ⅰ，在37°C水浴中酶解6~12h后，再加入30~70 mIU肝素酶Ⅰ，继续酶解6～12h；然后加热至100°C沸腾3min终止反应，10000 rpm离心10 min，取上清液，冻干；所述的步骤（4）具体为：取7种步骤（3）制得的纯样品各100 μg，分别加入5mIU的肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ复合酶解，并采用强阴离子交换色谱分析，色谱分离条件如下：流动相A为pH 2.0～4.0的超纯水，流动相B为pH 2.0～4.0、1.5～2.5M NaCl；样品溶解于1ml pH 3.5的水；色谱流速1ml/min；先冲2ml pH3.5的水；NaCl 线性梯度从 0‑0.5M、2.1‑35.1min，然后 0.5‑1.0M、35.1–57.1 min洗脱，对洗脱得到的寡糖检测；得到寡糖结构为：dp6a △HexA‑GlcNS‑HexA‑GlcNS‑HexA2S‑GlcNS6S；dp6b △HexA2S‑GlcNS6S‑ HexA2S‑GlcNAc‑ HexA 2S‑GlcNS6S；dp6c △HexA‑GlcNS6S‑HexA‑GlcNAc6S‑HexA2S‑GlcNS6S；dp6d △HexA‑GlcNS6S‑ HexA 2S‑GlcNAc6S‑ HexA 2S‑GlcNS6S；dp8a △HexA2S‑GlcNS‑[HexA2S‑GlcNAc‑HexA‑GlcNS]‑HexA2S‑GlcNS6S；dp8b △HexA2S‑GlcNS6S‑[HexA2S‑GlcNAc‑HexA‑GlcNS]‑HexA2S‑GlcNS6S；dp8c △HexA2S‑GlcNS6S‑[ HexA 2S‑GlcNAc‑ HexA‑GlcNAc6S]‑ HexA 2S‑GlcNS6S；最后利用质谱法测定寡糖的分子量；肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的复合配比为1:1:1。