一种制备重组链激酶的方法

摘要

一种重组链激酶的制造方法。现有技术的基因构建过程繁琐，大肠杆菌中表达水平低，纯化方案复杂。本发明方法用PCR扩增链激酶基因，与原核表达载体如PLY-4组装成表达质粒PSTE-SK-1，转化大肠杆菌后用温度诱导r-SK基因表达。工程菌经发酵扩增，破碎细菌，离心收集包涵体，复性后经二步法纯化r-SK。本方法所得产品的产量和纯度都很高，成本低。

主权项

1、一种重组链激酶的制备方法，包括链激酶基因质粒的构建，在大肠杆菌中的表达及其表达产物的纯化和大规模制造产品的工艺，其特征在于：(1)从人体口腔分离溶血性链球菌，培养液中提纯链激酶，测定N末端和C末端氨基酸顺序作设计PCR引物的参考。用溶血性链球菌大分子DNA作模板，通过PCR直接扩增链激酶基因，链激酶基因经核苷酸顺序分析证实后与原核表达载体，例如含PL，PR启动子，CIT857基因以及5SRNA终止信号等调控元件的PLY-4质粒组装成高效表达质粒pSTE-SK-1；(2)pSTE-SK-1转化大肠杆菌，用温度诱导r-SK基因的表达，以包涵体形成存在于工程菌内；(3)通过发酵技术扩增工程菌，用M9CAA作基础培养液，温度诱导前后用LB、葡萄糖、稀有元素溶液等进行数次补液，发酵参数为温度30-42℃，氧溶量为50-80%，PH6-8；(4)发酵后用高压破碎细菌，离心收集包涵体，包涵体经缓冲液洗涤，盐酸胍溶解，和r-SK的复性后，再用凝胶过滤，离子交换二步法纯化产品。