一种控制固定化酶空间取向的方法

摘要

本发明公开了一种控制固定化酶空间取向的方法。其步骤是通过基因操纵构建和表达酶—连接肽—链霉结合肽融合蛋白,制备融合蛋白纯品,超滤浓缩,测定酶动力学;通过链霉结合肽与链霉亲和素的专一性结合,使酶分子定向固定在经链霉亲和素包被的固相载体上,其活性中心朝向反应溶液。融合蛋白为“锚—链”分子系统,其中链霉结合肽为“锚”,控制酶分子固定的方向,连接肽为“链”,能增加酶与链霉结合肽之间的分子距离,既保持两者各自空间活动的灵活性,又减小了链霉结合肽与链霉亲和素的结合反应的空间位阻,从而大大提高定向固定效率。该方法剩余酶活高,均一性好,是定向固定酶分子的一种模式方法,适合于制作高质量生物传感器、生物芯片等生物器件。

主权项

权利要求书1、一种控制固定化酶空间取向的方法，包括下列步骤：A、基因融合，选择基因克隆和表达载体，通过基因操纵，将待固定的酶分子编码基因、连接肽编码序列和链霉结合肽基因依次拼接、构建酶与连接肽和链霉结合肽的融合基因，该融合基因编码的融合蛋白的一级结构为：酶-(N)末端-[(甘氨酸-丝氨酸)n]-链霉结合肽，其中10≥n≥3；B、融合基因表达，将携带融合基因的质粒转化到受体细胞，在选择性平板上挑选阳性转化子，在液体培养基中表达出融合蛋白；C、融合蛋白制备，离心培养基、收集、洗涤细胞，提取蛋白粗品，然后分离、纯化融合蛋白，浓缩，4℃保存；D、融合蛋白鉴定，确定融合蛋白为电泳纯后，用光吸收法或BIO-RAD试剂盒测定样品中融合蛋白浓度；E、融合蛋白酶活性检测及动力学测定；F、融合蛋白的固定化，通过融合蛋白上的链霉结合肽与载体上链霉亲和素的专一性结合使酶蛋白定向固定在载体上，其活性中心朝向反应溶液；G、固定化融合蛋白的性能鉴定。