聚乙二醇化红细胞生成素蛋白长效制剂

摘要

本发明公开了一类聚乙二醇化红细胞生成素，由非糖基化的rhEPO(rhngEPO)或其点突变体(rhngEPOm)与单一、单链的、分子量大于20kDa的PEG分子以N－末端氨基或半胱氨酸突变点的巯基定点偶联而成；其中所述聚乙二醇化红细胞生成素的分子结构式为：CH₃－(CH₂CH₂－O)n－(CH₂)r－NH－rhngEPO或CH₃－(CH₂CH₂－O)n－X－S－rhngEPOm，式中n为100～2200，r为0～4，X为S或C；本发明所述PEG－rhngEPO或PEG－rhEPOm分子同时具备长效、高效和低免疫原性的长效制剂特征，为制备用于治疗慢性肾功能不全所致贫血、肿瘤及艾滋病化疗所致的贫血、脑脊髓神经损伤以及择期手术自体输血的胃肠外长效制剂奠定了基础。

主权项

1.一类聚乙二醇化红细胞生成素，由非糖基化的rhEPO(rhngEPO)或其点突变体(rhngEPOm)与单一、单链的、分子量大于20kDa的PEG分子以N-末端氨基或半胱氨酸突变点的巯基定点偶联而成；其特征在于：所述聚乙二醇化红细胞生成素的分子结构式为：CH3-(CH2CH2-O)n-(CH2)r-NH-rhngEPO或CH3-(CH2CH2-O)n-X-S-rhngEPOm，式中n为100～2200，r为0～4，X为S或C；其中用于与rhngEPO或rhEPOm偶联的PEG为甲氧基化PEG，即mPEG，其分子式为：CH3-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH，n为100～2200；所述rhngEPO或rhngEPOm的氨基酸序列应符合SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列公式；其中所述rhngEPOm具备仅包含一个点突变位点且这一位点同时用于定点偶联PEG分子，并rhngEPO或rhngEPOm蛋白同时具备经UT7细胞/MTT法体外活性测定比活大于或等于rhEPO的比活；同时所述聚乙二醇化红细胞生成素还应具备下列特征：1)mPEG的分子量大于20kDa；2)mPEG是单链PEG，与rhngEPO或rhngEPOm偶联的分子比列为1：1，且为单一位点偶联；3)在体外热稳定性中，以50℃恒温处理PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm 15分钟，取样测体外细胞活性，活性应保持不变；4)在体外抗酶解试验中：将胰蛋白酶与PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm在37℃共同孵育4小时，取样经SDS-PAGE法测定，PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的酶解百分比应低于50％；5)PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的比活性应大于或等于1.5X10E6U/mg蛋白；6)PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm的血浆半衰期应比rhEPO的血浆清除半衰期大2倍以上；7)在免疫原性测定中，PEG-rhngEPO或PEG-rhngEPOm在第12周EPO抗体阳性率应小于20％。