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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren, bei dem eine Template-Nukleinsäure, mindestens ein Primer, Deoxyribonukleosidtriphosphate sowie eine DNA-Polymerase mit Proofreading-Aktivität eingesetzt werden. Zusätzlich wird erfindungsgemäß bei der Polymerase-Kettenreaktion noch mindestens ein Zielsubstrat zugesetzt, wodurch die Effizienz der DNA-Polymerase mit Proofreading-Aktivität signifikant erhöht wird. Als Zielsubstrat ist jedes Molekül geeignet, das die 3'-5'-Exonukleaseaktivität der verwendeten DNA-Polymerase reduziert oder im Optimalfall blockiert. Technische Lösungen für das zugesetzte Substrat (Zielsubstrat) sind insbesondere einzelsträngige, lineare Oligonukleotide, Haarnadel-Oligonukleotide, sowie RNA- und DNA-Moleküle. Außerdem wird ein Kit angegeben, der die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens benötigten Reagenzien enthält.
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