一种快速大量提纯质粒DNA的新方法

摘要

本发明涉及分子生物学研究领域，为一种简易快速大规模提纯质粒DNA的新方法。本方法所用试剂包括菌体清洗液、菌体重悬缓冲液、菌体裂解液、裂解中和液、异丙醇、硅藻土悬液、蛋白洗涤液、80％乙醇、DNA稀释液九种试剂和50ml-l00ml离心管。本发明与现有提纯方法比较操作简便，一次提取仅需90分钟。本发明结果稳定，得量高，纯度好，无蛋白质和RNA污染，与应用Qiagen柱式纯化试剂盒和国产赛百盛树脂型试剂盒提取相同的质粒DNA比较，所得DNA的电泳条带同样清晰，无RNA混杂。本发明价格低廉，不需用酚和氯仿等有毒试剂，经放大可用于DNA疫苗的制备。

主权项

1.一种快速大规模提纯质粒DNA的新方法，其方法特征在于按如下步骤操作：(1)按常规摇瓶大量培养细菌扩增质粒(详见《分子克隆试验指南》)；(2)取经常规培养18-20小时的菌体，取500ml菌液，室温以5000rpm离心10分钟，弃上清；(3)用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支50ml离心管中，室温以6000rpm 5分钟，弃上清；(4)沉淀中加5ml预冷的R1，充分振荡混匀；(5)加入10ml新鲜配制的R2，轻轻颠倒5次混匀，冰浴约10分钟；(6)加入7.5ml预冷的R3，轻轻颠倒5次混匀，冰浴约5分钟；(7)4℃，以12000rpm离心10分钟，取上清至另外的50ml离心管中；(8)加入0.6倍体积的异丙醇R4，颠倒混匀，室温放置10分钟，4℃，以12000rpm离心10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明；(9)加入5ml R8(TE)使之溶解；(10)加入5ml R5，取用时摇匀，室温吸附5分钟，12000rpm离心5分钟，弃去离心液；(11)加入5ml R6，室温12000rpm离心5分钟，弃去离心液；(12)加入5ml R7，室温12000rpm离心5分钟，弃去离心液，室温放置10分钟，使之干燥；(13)用1ml R8溶解，室温放置8分钟(或37℃放置5分钟)，解吸附，室温12000rpm离心5分钟，--20℃保存备用；