雷公藤再生植株的制备工艺

摘要

本发明公开了一种雷公藤再生植株的制备工艺，该工艺主要利用无性系变异、诱变、染色体加倍、再生和无激素繁殖等技术。该工艺制备的雷公藤再生植株不仅能在可控的标准化条件下大量繁殖，每代的繁殖系数可达5～6倍，且雷公藤内酯醇的含量为0.009～0.015％，总二萜内酯含量也比市售的雷公藤浸膏高，且他们能够保持稳定。

主权项

1.一种雷公藤再生植株的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：(1)雷公藤细胞或愈伤组织的无性系变异及诱变切取野生雷公藤或种子苗的幼嫩器官的组织作外植体，灭菌15～20分钟后，切成薄片，置于诱导培养基上，培养温度为22～25℃，经35～40天培养，诱导形成愈伤组织；将愈伤组织置于继代培养基中，继代培养2～3代，每代培养25～30天，培养温度为22～25℃，形成大量愈伤组织；大量愈伤组织置于液体培养基中，培养温度为22～25℃，在摇床上培养25～30天，转速为110～130转/分，形成悬浮培养细胞或细胞团；之后将细胞团置入经灭菌处理的诱变剂或染色体加倍剂溶液中共同培养12～24小时，培养物以无菌水洗净诱变剂或染色体加倍剂，置入修复培养基中浅层培养9～12天，培养温度为22～25℃；(2)雷公藤悬浮培养细胞或细胞团的植株再生然后将悬浮培养细胞或细胞团置入分化培养基中培养，每天光照10～12小时，培养温度为22～25℃，25～30天后从再生植株中选取正常型再生植株，置于增殖培养基中培养，然后选取生长粗壮的植株；(3)雷公藤再生植株的筛选再生植株通过切割增殖手段形成株系，从中选择粗壮、繁殖系数高的株系，每一株系取一定量的植株进行总二萜内酯含量测定，从中选择含量高的株系，所选总二萜内酯含量高的株系再进行雷公藤内酯醇测定，从中选择内酯醇含量高的株系；(4)雷公藤再生植株的无激素培养驯化所选的有效成分含量高且增殖速度快的雷公藤再生植株依次置于6-苄基氨基嘌呤浓度分别为0.5mg/L、0.1mg/L、0mg/L的驯化培养基上，在22～25℃，培养25～30天，每天光照10～12小时，最后，从无激素培养基上选取生长快且有效成分含量高的株系；上述步骤中，诱导培养基配方为：2/3MS、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、萘乙酸0.1 mg/L、激动素0.1mg/L、5％蔗糖、0.6％琼脂；液体培养基为：2/3N6、500mg/L水解酪蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、吲哚乙酸0.5mg/L、激动素0.1mg/L、4％山梨糖；继代培养基为：2/3N6、500mg/L水解酪蛋白、2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L、激动素0.1mg/L、4％蔗糖、0.6％琼脂；修复培养基为：2/3MS、15％椰汁、3％山梨糖；分化培养基为1/2MS、吲哚乙酸0.1mg/L、激动素0.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤1.5mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂；增殖培养基为：2/3MS、500mg/L水解酪蛋白、激动素0.5mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.1mg/L、3％蔗糖、0.6％琼脂；驯化培养基为：2/3MS、3％蔗糖、0.6％琼脂。