単一アミノ酸分割での変異可能なリガンド−ＧＰＣＲ結合を決定するための方法、および変異リガンドとＧＰＣＲとの対

摘要

本発明は、Ｇタンパク質共役受容体であって、以下ＧＰＣＲと称されるものとする前記Ｇタンパク質共役受容体と変異可能なリガンドとの結合能を決定するための方法において、前記方法が、以下のステップ：ａ）第一の行数および第二の列数を有する配列状に配置されたウェルを有するウェルマイクロタイタープレートを準備するステップ；ｂ）ＧＰＣＲ、例えばロドプシンを前記ウェルの各々に供給するステップ；ｃ）親リガンドの多数の変異体を準備するステップであって、その際、前記親リガンドは、前記ＧＰＣＲが特定の立体構造で存在している場合に前記ＧＰＣＲに結合するリガンドであるものとする、前記ステップ；ｄ）前記ウェル中の親リガンドの変異体を、前記親リガンドが前記ＧＰＣＲに結合する条件下に、前記ＧＰＣＲと接触させるステップ；ｅ）各々の変異体について、前記ウェル中の結合した変異体−ＧＰＣＲ複合体の量を測定することにより、前記変異体リガンドが、前記親リガンドと前記ＧＰＣＲとの標準的な結合能と比較して弱い結合能を有しているかまたは強い結合能を有しているかを決定するステップを含む前記方法を提供する。アッセイにおいて、完全なアレスチンの配列をカバーする４０３種の変異体のロドプシン結合を検査した。この情報は、不活性型、予備活性化型および活性型アレスチンの結晶構造に対して機能的な第４の次元を提供する。得られた単一アミノ酸分割機能マップによって、極性コア内での、およびアレスチン活性化の間に中断されるアレスチンのＣ尾部に沿った、一連の重要な相互作用が明らかとなる。本発明者らはさらに、結合を強度に減少させかつロドプシンへの直接結合インターフェースとして作用するアミノ酸の複数のパッチを明らかにした。この情報と、活性型アレスチン4および光活性化ロドプシンの計算分子ドッキングとを組み合わせることにより、アレスチン−ロドプシン複合体のモデルを創出することができる。変異体の組み合わせによって、診断目的または薬理学的介入創薬のためのＧＰＣＲ−リガンド複合体の結合親和性および安定性の変更が可能となる。