心肌细胞蛋白质差异表达图谱的构建与应用

摘要

本发明提供药物诱导干细胞定向分化时蛋白质差异表达图谱的构建方法，具体构建了ICA诱导干细胞定向分化为心肌细胞的蛋白质差异表达图谱，通过建立药物诱导干细胞定向分化为心肌细胞模型，制备二维电泳蛋白质样品，双向凝胶电泳，图像采集分析，明确差异蛋白。运用比较蛋白质图谱筛选鉴定出ICA诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的差异表达蛋白，利用差异表达蛋白作为药物作用靶位，在制备高效低毒新型促进干细胞分化诱导剂中的应用。

主权项

1.一种心肌细胞蛋白质差异表达图谱的构建方法，其特征是：通过以下步骤实现：(1)建立药物诱导干细胞定向分化为心肌细胞模型：ES细胞经悬滴培养形成拟胚体，加入药物ICA诱导其定向分化为心肌细胞；(2)制备二维电泳蛋白质样品：收集上述不同分化时相的分化细胞，加入裂解缓冲液混匀，液氮中反复冻融3次，加50μg/ml RNase及200μg/mlDNase，在4℃放置15分钟，16100转离心，弃上清，再用1％二硫苏糖醇预冷丙酮洗两遍，室温干燥1小时，水化液溶解后测蛋白浓度，上述裂解缓冲液组成含10％三氯乙酸丙酮冷溶液和1％二硫苏糖醇，水化液组成含8mol/L尿素，4％CHAPS和0.001％溴酚蓝；(3)双向凝胶电泳：分别取步骤(2)的蛋白质各100μg与溶胀液混合，加入IPG持胶槽中进行等电聚焦，结束后胶条在平衡液中平衡20分钟，将胶条移至SDS-PAGE分离胶上，以恒流方式电泳得凝胶，上述溶胀液组成含8mol/L尿素，4％CHAPS，65mmol/L DTT，0.2％Bio-Lyte和0.001％溴酚蓝；(4)图像采集分析：上述所得凝胶经染色后，扫描得到的图像用PDQUEST软件进行分析，ES细胞自发分化为心肌细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，ICA诱导组的双向电泳图谱与之进行配比，获得ICA诱导分化的差异表达蛋白质，上述凝胶染色采用银染法；(5)同步骤(3)获得凝胶，然后采用考马氏亮蓝法染色，差异蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，鉴定并筛选出差异蛋白；(6)明确差异蛋白后，其生物学功能即可确定，或作蛋白印迹进一步验证。