大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统

摘要

本发明提供了一种吸取4-甲基伞形基-β-D-葡糖醛酸苷(MUG)中水解后发荧光的4-甲基伞形酮部分和邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)中能被β-GAD酶水解的半乳糖苷部分，将两者合成4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷(MUGAL)，以MUGAL为底物，在37℃下若被水解产荧光显示检样中存在总大肠菌群；在44.5℃下水解产荧光则显示存在粪大肠菌群，再结合微孔膜技术的应用和相应的配套器材，发展和完善现场快速定量检测系统。

主权项

1.一种大肠菌群膜荧光法现场快速定量检测系统，其特征是： 1.以半乳糖和4-甲基伞形酮为主要原料，采用三步亲核取代反应， 合成4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷(MUGAL)获白色针状结晶 纯品，其具体程序如下：步骤(1)：于三颈瓶中加入乙酐和高氯酸，在搅拌下加入半乳糖，在 冰水浴冷却下加入PBr₃，加毕，在搅拌下加入水，放置2h后加入氯 仿萃取，萃取液用水和NaHCO₃溶液分别洗涤，用CaCl₂干燥后减压 蒸去氯仿，残余物用乙醚和石油醚混合液处理得到溴代乙醚半乳糖 (I)，收率72.7％；(2)取(I)及4-甲基伞形酮溶解于丙酮中，在搅拌下加入1mol/ L的NaOH溶液，放置，减压蒸去丙酮，残余物用氯仿萃取，萃取 液用5％NaOH及水分别洗涤后减压蒸去氯仿，用乙醇溶液重结晶， 得白色晶体为乙酰化MOGAL(II)mp163℃，收率65％； (3)于反应瓶中加入(II)及甲醇搅拌成悬浊液，然后加入1mol/ L甲醇钠溶液，放置。过滤，固体用水洗后干燥，用混合溶剂重结晶， 得白色针状结晶，即为MUGAL，mp233℃，收率90％； 通过正交试验获得含MUGAL最传的培养液配方：培养液 成分如下：K₂HPO₄1％；NaNH₄HPO₄0.35％； MgSO₄·7H₂O0.02％；NaCl0.02％；枸橼酸钠0.05％； Mn⁺⁺，Zn⁺⁺微量(0.5ug/L)；蛋白胨0.15％；牛肉膏0.03％； 乳糖0.35％；十二烷基硫酸钠0.02％；去氧胆酸钠0.01％； MUGAL0.0075％；异丙基硫状半乳糖苷0.1％； 将酶-底物荧光反应与微孔膜技术相结合：采用孔径为0. 45um的微孔膜及手动滤过装置，使具有lacZ基因的大肠菌群阻留 在滤膜上，再用浸润有底物的培养液支持，大肠菌群的β-GAD酶 使底物水解形成色泽、形态、出现时间具有特征性的荧光斑点，以 此来定量检测大肠菌群。