基于双抗体夹心免疫分析的抗体微阵列的构建方法

摘要

一种基于双抗体夹心免疫分析的抗体微阵列的构建方法，其特征在于构建步骤为：载体的制备；载体的活化；捕获抗体的点样固定；基于微阵列的免疫分析。依据本优化后的操作流程所构建的抗体微阵列，具有较好的可重复性(组内及组间变异＜10％)和定量分析的能力(抗原浓度和信号强度的标准曲线相关性＞0.95)，为平行性、多因子蛋白质定量检测提供了可靠的技术平台。此外，点样后芯片保存稳定，活性至少可维持2个月，为该芯片的产业化和规模化提供了重要的条件。

主权项

1.一种基于双抗体夹心免疫分析的抗体微阵列的构建方法，其特征在于构建步骤为：a.载体的制备：超纯水配制0.5-1.5％琼脂糖溶液，加热煮沸至完全溶解，将琼脂糖溶液覆盖至预热的清洁玻片上，在室温下凝固后置37℃烤箱烘干，置室温保存备用；b.载体的活化：将步骤a所制得的载体浸入浓度为20mmol/L的NaIO4 溶液中活化20-30min，0.1M pH7.4 PBS洗涤，用氮气流将活化后的载体吹干；c.捕获抗体的点样固定：首先配制pH9.0，含甘油200ml/L的0.1mol/LNa2HPO4点样缓冲液，捕获抗体用点样缓冲液按最佳滴定浓度稀释后加置点样板孔中，然后在点样板孔上设置阳性控制和阴性控制点样，作为微阵列方向指示和质量控制，最后按预先设计阵列在步骤b所得载体上点样，点样后载体置湿盒密封，置4℃环境中过夜固定。d.基于微阵列的免疫分析：在37℃恒温水浴中，用含浓度为1-5％BSA的PBS溶液对载体上抗体的非特异性结合位点进行封闭处理1-2小时；PBST洗涤载体后用氮气吹干；对同一载体不同亚阵列覆盖抗原溶液或待测标本，覆盖量为4ul/阵列，覆盖后将载体置密闭湿盒中，于37℃恒温水浴反应1-2小时；PBST洗涤载体后用氮气吹干；对同一载体不同亚阵列覆盖检测抗体，覆盖量为4ul/阵列，置密闭湿盒，37℃恒温水浴反应1-2小时；PBST洗涤载体后用氮气吹干；对同一载体不同亚阵列覆盖链酶亲和素-cy3，覆盖量为4ul/阵列，置密闭湿盒，37℃恒温水浴反应20-30分钟，PBST洗涤后用氮气吹干，最后用激光共聚焦扫描仪扫描载体，对图片进行荧光强度数据分析。