中药作用机理的测定方法

摘要

本发明的技术方案涉及应用生物传感分析技术来测定中药作用机理的方法，应用压电石英晶体微天平检测中药有效成分与细胞因子的相互作用、与细胞因子受体的相互作用、以及对细胞因子与其受体间相互结合的影响情况，分析中药有效成分的作用靶点和作用机理，弄清中药的作用机理，并且可以由此进行中药的筛选及其配伍，本发明方法具有实时性、高效性、敏感性、特异性、简易性、客观性的优点。

主权项

1.中药作用机理的测定方法，其特征在于：应用压电石英晶体微天平检测中药有效成分与细胞因子的相互作用、与细胞因子受体的相互作用、以及对细胞因子与其受体间相互结合的影响情况，分析中药有效成分的作用靶点和作用机理，具体的操作步骤是：第一步，细胞因子生物素衍生化：将4～100μg细胞因子加入200～500μL浓度为0.01mol/L pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中；将1～2mgSULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶于120μL去离子水中，取其20～50μL加入上述细胞因子溶液中，混匀，室温下避光反应4小时后，在4℃温度下，以10000转/分钟超滤离心10分钟，截留物溶解于200μL磷酸盐缓冲液中，完成细胞因子生物素衍生化；第二步，细胞因子受体生物素衍生化：将4～100μg细胞因子受体加入200～500μL0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液中；将1～2mgSULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶于120μL去离子水中，取其20～50μL加入上述细胞因子受体溶液中，混匀，室温避光反应4小时后，在4℃温度下，以10000转/分钟超滤离心10分钟，截留物溶解于200μL磷酸盐缓冲液中，完成细胞因子受体生物素衍生化；第三步，将生物素衍生化的细胞因子受体接合在压电石英晶体微天平的金石英晶体基片表面，观察细胞因子与其受体相互作用：A.将亲和素接合到压电石英晶体微天平的金石英晶体基片上：先将压电石英晶体微天平的金石英晶体基片用去离子水清洗，再用纯甲醇浸泡1小时，然后用去离子水冲洗3遍，再用超声波清洗3分钟，晾干，在基片表面加10μL浓度为10mmol/L的α-硫辛酸，平衡30分钟后，用去离子水冲洗，依次加入活化剂100mg/mL盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和100mg/mL N-羟琥珀酰亚胺各10μL，平衡20分钟，用去离子水冲洗，最后加入20μL浓度为2mg/mL亲和素Strepavidin，平衡1小时，收集数据；B.生物素衍生化细胞因子受体包被压电石英晶体微天平的金石英晶体基片：在经过上述处理的压电石英晶体微天平的金石英晶体基片上加入上述第二步中制取的20μL生物素衍生化的细胞因子受体，反应30～50分钟，用50μL PBS冲洗，采集数据，PBS为由0.01M磷酸钠、0.138M NaCl和0.027M KCl配制成的、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；C.细胞因子与其受体结合反应：在经过上述处理的压电石英晶体微天平的金石英晶体基片上加入浓度为0.05～0.5mg/mL的20μL细胞因子，结合反应30～50分钟，用50μLPBS冲洗，采集数据；第四步，将生物素衍生化的细胞因子受体接合在压电石英晶体微天平的金石英晶体基片表面，观察细胞因子受体与中药有效成分相互作用：A.同第三步的A；B.同第三步的B；C.细胞因子受体与中药有效成分结合反应：在经上述处理的压电石英晶体微天平的金石英晶体基片上加入浓度为10-5～10-1M的20μL至少含一种中药有效成分的溶液，结合反应20～30分钟，用50μL PBS洗3遍，采集数据；第五步，将生物素衍生化的细胞因子接合在压电石英晶体微天平的金石英晶体基片表面，观察细胞因子与中药有效成分相互作用：A.同第三步的A；B.生物素衍生化细胞因子包被压电石英晶体微天平的金石英晶体基片：在经过上述处理的压电石英晶体微天平的金石英晶体基片上加入上述第一步中制取的20μL生物素衍生化的细胞因子，反应30分钟，用50μL PBS冲洗，采集数据，PBS为由0.01M磷酸钠、0.138M NaCl和0.027M KCl配制成的，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；C.细胞因子与中药有效成分结合反应：在经过上述处理的压电石英晶体微天平的金石英晶体基片上加入浓度为10-5～10-1M的20μL至少含一种中药有效成分的溶液，结合反应20～30分钟，用50μL PBS洗3遍，采集数据；第六步，将生物素衍生化的细胞因子受体接合在压电石英晶体微天平的金石英晶体基片表面，观察中药有效成分对细胞因子与受体结合的影响：A.同第三步的A；B.同第三步的B；C.中药有效成分对细胞因子与其受体结合的影响：在经上述处理的压电石英晶体微天平的金石英晶体基片上加入浓度为0.05～0.5mg/mL的20μL细胞因子与浓度为10-5～10-1M的20μL至少一种中药有效成分的混合液，结合反应20～30分钟，用50μL PBS洗3遍，采集数据；第七步，实验结果：对实验采集的晶体震荡频率发生变化的数据所形成的反应曲线进行分析，可以确定中药有效成分对细胞因子与其受体相互结合的影响，从而看出有些中药有效成分可增强某些细胞因子与其受体的结合，有些中药有效成分可抑制某些细胞因子与其受体的结合，有些中药有效成分则不影响某些细胞因子与其受体的结合，由此，可进一步推论和证实中药的作用机理：影响细胞因子-受体体系的相互结合也是中药有效成分在体内的作用位点之一，中药有效成分通过调节某些细胞因子与其受体的相互结合，从而影响或改变细胞因子的功能与生理、病理作用，进而发挥对疾病的疗效；进而根据不同中药有效成分以及它们的不同配伍所进行的对比实验，得出不同中药有效成分及其不同的配伍对细胞因子与其受体结合影响的强弱程度，可进一步研究中药配伍机理及药物筛选和新药开发。