单花粉全基因组扩增库的快速制备方法

摘要

植物单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，具体涉及植物单花粉的分离、快速裂解和全基因组复制扩增。本发明的技术方案是：在载玻片上将花粉染色、干燥，制备花粉粒玻片；应用一种显微解剖镊子在显微镜下分离单个花粉，放入PCR管中，在碱和表面活性剂溶液中裂解后用TE缓冲溶液中和。裂解混合液直接作为模板在试剂盒Genomiphi DNA Amplification Kit方法中工作，将单个花粉的DNA复制扩增出大量全基因组，该方法能应用于大批量单花粉收集并制备全基因组，为植物单倍体遗传规律分析和通过单倍体染色体制图提供了一种新的途径。

主权项

1、一种单花粉全基因组扩增库的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)滴1-2滴染色液在载玻片上备用；将供试作物的花药浸入染色液中，在显微镜下用镊子分离，取单个完整、干净、未开裂的花药，然后用镊子挑破花粉囊壁，释放出花粉粒；染色后，将染色液排净，用30mM灭菌蔗糖液清洗留下的花粉粒，待花粉粒干燥后制成花粉粒玻片，整个操作过程在无菌环境中进行；所述染色液组成成分为0.7mM苯胺磷酸氢二铵蓝和30mM蔗糖的水溶液；(2)分装0.5μl裂解液于96孔PCR板的PCR管中，密封并离心，使裂解液沉于管底；应用镊子直接在显微镜下分离着色的单个花粉粒，放入96孔PCR板的PCR管底的裂解液中；(3)分装5μl矿物油于含裂解液和单个花粉粒的96孔PCR板的PCR管中，密封并短暂离心；所述裂解液的组成成分为终浓度0.1M的NaOH与2％的Tween-20水溶液的混合液；(4)在PCR仪上裂解后用与裂解液等体积的TE缓冲溶液中和，成为裂解混合液；(5)每管中的裂解混合液分别全部作为一次反应的模板直接进行全基因组扩增。