用于产生由单分子DNA形成的环状DNA的方法

摘要

本发明提供了用于产生环状DNA的方法，所述环状DNA由单分子DNA形成的环状DNA组成，并且其不包括由多分子DNA形成的环状DNA。根据本发明的方法，可以可靠地产生仅由单分子DNA形成的环状DNA分子。

主权项

一种用于产生环状DNA的方法，所述环状DNA由单分子DNA形成的环状DNA组成，并且其不包含由多分子DNA形成的环状DNA，所述方法包括以下步骤：1)使每个目标DNA分子的一端与用于第一环化的适配体A结合并且使其另一端与用于第二环化的包含适配体b和适配体A的适配体B结合的步骤，其中适配体B通过适配体b侧与所述DNA分子结合，从而使得适配体B中的适配体A位于所述DNA分子与适配体b之键的外侧，其中适配体A是包含识别回文序列之限制性酶位点的双链DNA，和适配体B包含适配体b和适配体A，其中适配体b是双链DNA，其包含彼此取向相反的相同产切口酶识别位点，其中适配体b是双链DNA，其包含在彼此取向相反的相同产切口酶识别位点之间具有对于每个适配体b来说特有的序列的双链DNA序列，所述特有的序列由4至15个核苷酸组成，如果在彼此取向相反的相同产切口酶识别位点切割适配体b，那么切割位点仅与来自相同适配体b的切割位点再结合；2)利用识别适配体A中所包含的限制性酶位点的限制性酶切割在步骤1)中得到的DNA分子的第一切割步骤；3)连接在步骤2)中得到的DNA分子的两端以环化所述DNA分子的第一环化步骤；4)除去步骤3)中未环化的线性单分子和由多个DNA分子的线性结合形成的线性分子的步骤；5)利用识别适配体b中的产切口酶识别位点的产切口酶切割在步骤4)中得到的环状DNA分子的第二切割步骤；和6)连接在步骤5)中得到的DNA分子的两端以环化所述DNA分子的第二环化步骤。