一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法

摘要

一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原。本发明成功的合成甲羟孕酮人工抗原，合成过程简单，抗原产物暴露了孕激素共同结构，为以后筛选群选性甲羟孕酮单克隆抗体奠定基础，得到的群选性单克隆抗体可以满足国内对孕激素多重检测的需求。

主权项

一种甲羟孕酮人工抗原的合成方法，其特征在于以甲羟孕酮为原料，通过氢氧化钾和二溴乙酸进行取代，得到甲羟孕酮半抗原，利用混合酸酐法将其与载体蛋白BSA或OVA偶联，得到甲羟孕酮人工抗原；具体合成步骤：（1）甲羟孕酮半抗原的制备：取甲羟孕酮0.1mmol溶解于3mL无水二甲亚砜中为A液，二溴乙酸0.2mmol溶解于1.4mL无水二甲亚砜中为B液，A液中加入氢氧化钾粉末1.5mmol，室温条件下搅拌至溶液颜色变为微黄色，将B液逐滴加入到A液中，黄色逐渐加深，溴取代甲羟孕酮17位羟基上的H键，室温反应4h，用50mL冰水终止反应，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，将水相用2mol/L盐酸酸化得黄色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黄色甲羟孕酮半抗原粉末；（2）甲羟孕酮人工抗原的制备：称取甲羟孕酮半抗原0.01mmol溶解于600μL无水N,N‑二甲基甲酰胺DMF中，置于4℃冰浴中搅拌，溶液预冷后加入0.025mmol三正丁胺，冰浴条件搅拌30min，加入0.025mmol氯甲酸异丁酯，继续冰浴搅拌1h，得活化后小分子溶液C液；称取载体蛋白BSA 10.6mg，溶解于pH 9.6的碳酸盐缓冲液CBS中，得蛋白溶液；在冰浴条件下，将小分子溶液C液逐滴滴加到蛋白溶液中，反应8h；反应结束后，将溶液离心，取上清，得到甲羟孕酮人工抗原混合液；剪取透析袋煮沸消毒，将甲羟孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液PBS透析三天，期间每天换液三次，透析结束后取出甲羟孕酮人工抗原分装在1mL的无菌的离心管，在‑20℃保存，备用；该甲羟孕酮人工抗原，即甲羟孕酮半抗原‑BSA，作为免疫原；将载体蛋白由BSA换为OVA，方法不变，合成的甲羟孕酮人工抗原，即甲羟孕酮半抗原‑OVA，作为包被原。