一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法

摘要

本发明公开了一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法，首先利用中性蛋白酶分离毛囊的表皮部分和真皮部分，先利用I型胶原酶分离皮肤表、真皮层后拨出毛囊，再对毛囊进行胰蛋白酶消化处理，随即将毛囊培养于含有表皮生长因子、类胰岛素生长因子‑I、氢化可的松和10％FBS的DMEM/F12培养液中，置5％CO2的37℃饱和湿度培养箱中进行培养。当培养板中的毛囊迁移出大量细胞时，换为含EGF、IGF‑I和氢化可的松的无血清角质细胞培养液中启动原代培养。待原代毛囊干细胞生长至汇合时，进行传代，将稳定生长至3～5代的细胞更换含EGF、IGF‑I、氢化可的松和2％FBS的DMEM/F12培养液中培养，以利于毛囊干细胞在体外长期传代培养。采用该方法本细胞系已经稳定传至5代以上，其生长分裂状态良好。

主权项

一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采集皮肤样品：无菌操作取细毛羊耳部皮肤0.5cm×0.5cm大小的含完整毛囊的皮肤组织样品，将样品用碘酒消毒，浓度为75％酒精消毒2次，再用生理盐水反复清洗，然后用含有青霉素‑链霉素的D‑Hank’s平衡盐溶液快速冲洗3～5次，迅速将样品放入无血清的DMEM/F12培养液中，于冰盒内带回实验室，在12h内进行分离培养；(2)在玻璃培养皿中，将软骨与皮肤剥离，在体式显微镜下用解剖针固定皮肤，在不损伤毛囊的前提下将毛囊周围组织尽量剔除，将皮肤标品在无菌条件下用眼科剪剪成小条，加入2.4U/mL的I型胶原酶，4℃消化12h后，终止消化，用眼科镊夹住毛囊远端从脂肪端拉出，收集形态完好且处于生长期的毛囊，分别在皮脂腺的下方和竖毛肌的上方横切获得中间毛囊隆突区；(3)分离获得毛囊隆突区后，再置于0.25％胰酶中37℃消化30min，终止反应，1200r/min离心收集细胞后接种于100μg/mL的IV型胶原包被的培养皿中，30min后吸出上层未贴附的角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞；(4)在培养皿中加入3ml完全培养液，37℃，5％CO₂浓度的饱和湿度条件下进行原代培养；所述完全培养液为：10ng/ml EGF、10ng/ml IGF‑I、0.5μg/ml氢化可的松和10％FBS的DMEM/F12培养液；(5)当毛囊干细胞生长至会合状态后，进行传代培养，首先弃掉旧培养液，D‑Hank’s液冲洗细胞一次，加入1ml浓度为0.25％的胰蛋白酶浸润细胞数秒，弃去后，再加入3ml浓度为0.25％的胰蛋白酶，常温下消化处理5min，加入工作培养液，1000r/min下离心5min后收集细胞，分瓶后按每瓶5ml量加入维持培养液放回培养箱中继续培养，每3天更换工作培养液1次；待毛囊干细胞稳定生长至3‑5代时，更换等量的维持培养液进行培养，以使毛囊干细胞在体外长期传代；所述工作培养液为：10ng/ml EGF、10ng/ml IGF‑I、0.5μg/ml氢化可的松的K‑SFM培养液；维持培养液为：10ng/L EGF、10ng/ml EGF、10ng/ml IGF‑I、0.5μg/ml氢化可的松和2％FBS的DMEM/F12培养液；(6)选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入含10％DMSO和30％FBS的DMEM/F12冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h，‑20℃1h，‑70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×10⁵个/ml的细胞密度接种于培养瓶。