主权项 |
一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法,其特征在于,选择规格均匀、体格健壮的平均体重400‑600 g的鲤鱼预养2周,然后,在无菌条件下进行如下过程:a.无菌取鲤鱼肝脏和鲤鱼肝脏预处理:用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后,用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白,用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌,再沿鳃盖后缘剪至下颌,打开左侧体壁肌肉,找到鲤鱼肝脏所在位置,用高压灭菌的解剖器具无菌取肝脏,并将之置于D‑Hank’s平衡盐工作液中,用D‑Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织2‑3次至肝脏发白,以洗去肝脏组织中残留的血液,完成鲤鱼肝脏预处理过程;b.机械破碎鲤鱼肝脏和对鲤鱼肝脏和消化处理:将在所述步骤a中选取和经过预处理的鲤鱼肝脏剪碎成约1 mm × 1 mm 块状,再用D‑Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织块至少1次,然后加入块状鲤鱼肝脏的10倍体积的0.25%胰酶,在在25℃条件下进行40 min消化处理,在消化期间不断转动肝脏组织,消化处理后吸出大块肝脏组织,用移液枪温和吹打用机械切割力帮助肝脏组织消化,当向加入与胰酶同体积的培养基时停止消化过程,得到肝脏组织消化液;c.细胞悬液的制备:将在所述步骤b中制备的肝脏组织消化液经孔径为100 μm细胞筛网过滤,得到细胞悬液,然后以1000 rpm离心5 min后,再移去上清,接着加入培养液轻轻吹打,使肝脏细胞重悬,然后用移液枪将细胞悬液缓慢温和地加到Percoll分离液上方,使Percoll分离液和细胞悬液的体积比为7:3,采用Percoll分离液的浓度为70wt%,然后在4℃条件下,以1000 rpm再次离心10 min,再取底层的肝脏细胞沉淀,然后将分离出来肝脏细胞中加入细胞培养液,并轻轻吹打,使肝脏细胞重悬,再次得到细胞悬液;d.鲤鱼肝脏细胞培养:用细胞培养基液稀释在所述步骤c中最后制备的细胞悬液,使细胞悬液稀释到1×10<sup>6 </sup>cells/ml的浓度水平,然后采用铺板法培养鲤鱼肝细胞,采用具有96孔板且每孔为200 μl板进行铺板,使鲤鱼肝细胞在26℃条件下进行培养增殖,最终得到离体鲤鱼原代肝细胞;在所述步骤a和b中,D‑Hank’s平衡盐工作液组成为:由99 ml的无Ca<sup>2+</sup>Mg<sup>2+</sup>的HBSS和1 ml的浓度为1wt%双抗储液混合制备而成;在所述步骤c中,Percoll分离液的配制:采用Percoll原液90 mL与无Ca<sup>2+</sup> Mg<sup>2+</sup>HBSS的10 mL进行混合,制成渗透压为335 mOsm的Percoll工作液,然后取35 mL的Percoll工作液与15 mL无Ca<sup>2+</sup> Mg<sup>2+</sup>HBSS进行混合,并在1000 rpm条件下离心3 min,即获得浓度为70wt%的Percoll梯度分离液,并控制Percoll梯度分离液的密度为1.06~1.07 g/mL,即得到所需的Percoll分离液,备用;在所述步骤d中,进行铺板法时所用的培养基液组成为:按照70 ml的L‑15培养基、20 ml的DMEM培养基、10 ml的鲤鱼血清、1 ml的浓度为0.01 M的Hepes缓冲液、1 ml的浓度为1wt%的双抗储液的混合组分配比进行混合,然后在按照上述组分比例配制培养基液后,再用浓度为1 M的 NaOH储液调节培养基液的pH至7.0‑7.4之间,然后用0.22 μm滤头过滤分装培养基液,得到培养基液,为铺板法备用;在制备培养基液时,其中鲤鱼血清的制备方法如下:用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后,用无菌注射器从尾静采集鲤鱼血液,并将其置于不含抗凝剂的试管内,在室温下自然凝集30‑40 min,密封试管,以2000‑3000 rpm的速度离心10min,用移液枪将血清移出,然后在‑20℃下进行保存,备用进行培养基液的制备。 |