黄鳝凝血酶的制备工艺及应用

摘要

本发明是一种黄鳝凝血酶的制备工艺，其特征在于，在黄鳝泄殖孔后剪去其尾部，得黄鳝血液，经干燥获得黄鳝全血干粉；取黄鳝全血干粉，经离心得到上清液，再将上清液透析得样液；然后洗脱分离样液中的凝血酶，根据蛋白质层析系统配套软件显示的分离峰，分别收集3个分离峰，并依次命名为MAB－I，MAB－II和MAB－III；分离峰经凝血酶活性检测得到具有凝血活性的黄鳝凝血酶MAB－II。本发明选用黄鳝血液作为研究对象，在黄鳝血液的制备时选用剪尾取血方法；在分离选用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂；本发明方法可有效地排除了其他带有阳离子的蛋白质，提高了纯化效率，所得的黄鳝凝血酶具有较佳的凝血活性。

主权项

1、一种黄鳝凝血酶的制备工艺，其特征在于，其步骤如下，(1)取血：黄鳝放入水中排除体内杂物后，在黄鳝泄殖孔后0.9-1.1cm处剪去其尾部，将血液流滴于培养皿中，得黄鳝血液，培养皿中黄鳝血液的厚度1.5-2.0mm；(2)干燥：将上述盛有血液的培养皿用纱布遮盖并置于室温自然风干，获黄鳝全血干粉；(3)样液制备：称取0.5g黄鳝全血干粉，用10mL 0.05mol/L、pH7.0的Tris-HCl缓冲液充分溶解，于4℃、8000rpm离心20min，取上清液；用移液器将10mL上清液移入截留分子量为3500的透析袋中，透析袋放入盛有800mL 0.05mol/L、pH7.0的Tris-HCl缓冲液的容器中，在4℃下透析6h，中间换水2-3次，得样液；(4)分离：选用DEAE Sepharose Fast Flow填料，加入适量0.05mol/L、pH7.0的Tris-HCl缓冲液，用玻璃棒搅拌并将其引流到1.5cm×12cm层析柱中，胶体积11mL，连接Biologic Duoflow蛋白质层析系统，选用A：0.05mol/L、pH 7.0的Tris-HCl和B：含NaCl 0.5mol/L的0.05mol/L、pH 7.0的Tris-HCl两种洗脱液，设定流速1.50mL/min，且洗脱过程中当A280大于0.03时开始收集，每管收集1.5mL；按下述程序洗脱分离样液中的凝血酶：①洗脱液A平衡2个柱体积；②走基线；③自动进样液5mL；④洗脱液A洗脱2个柱体积；⑤0％-100％洗脱液B洗脱4个柱体积；⑥洗脱液B洗脱2个柱体积；⑦洗脱液A洗脱2个柱体积；根据Biologic Duoflow蛋白质层析系统配套软件显示的的分离峰，分别收集3个分离峰，并依次命名为MAB-I，MAB-II和MAB-III；即得MAB-I，MAB-II和MAB-III 3种样品；(5)分离峰的凝血酶活性检测：在离心管中加入3.8％柠檬酸钠溶液2mL，然后向离心管中加入鸡血至20mL处，保持柠檬酸钠的终浓度为0.38％，于4℃、8000rpm离心20min，上清液即为鸡血浆；凝血酶活性检测反应体系为：在试管中加1mL鸡血浆，100μL步骤(4)所得的样品，混匀，再加入60μL、0.4mol/L的CaCl2，检测得到具有凝血活性的黄鳝凝血酶MAB-II。