一种检测β-淀粉样蛋白寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于检测β-淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体的类免疫电化学传感器及其制备方法，属于生物传感和电分析化学检测技术领域。本发明将金纳米粒子与巯基修饰的核酸适配体及硫堇共同作用形成稳定的纳米共轭物；同时在羧基化氧化石墨烯修饰的电极表面进行抗体的固定；识别Aβ寡聚体后进一步结合核酸适配体修饰的金纳米粒子共轭物，从而形成夹心型类免疫传感器；通过硫堇的电化学信号实现对Aβ寡聚体的测定。所述传感器灵敏度高、特异性好及稳定性高；与传统免疫传感器相比，具有制备简单及避免使用酶标抗体试剂的特点，可用于脑脊髓液中Aβ寡聚体的检测，促进阿尔茨海默病的早期诊断，具有临床应用价值。

主权项

用于检测β‑淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体的类免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，通过如下方法实现：(1)、选用核酸适配体选用与Aβ寡聚体具有强结合能力的核酸适配体，其序列为：GCCTGTGTTGGGGCGGGTGCG，并进行5'SH C6的修饰；(2)、制备AuNPs溶液：将柠檬酸溶液加入到煮沸的HAuCl₄·4H₂O溶液中，搅拌反应，然后冷却到室温，得AuNPs溶液，放置在冰箱中备用；取制备好的AuNPs和硫堇溶液混合，室温下搅拌，离心，取下层，用培养液溶解；最后加入上述核酸适配体，在室温搅拌下反应，经离心、洗涤、溶解，即得到核酸适配体和硫堇共同修饰的AuNPs共轭物；(3)、氧化石墨烯的合成及羧基功能化采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯： A、低温反应阶段，在0‑4℃冰浴中，加入浓硫酸，再加入石墨粉及硝酸钠，搅拌反应后从冰浴中取出 ，10‑20℃条件下，缓慢加入高锰酸钾并持续搅拌反应；B、中温反应阶段，将上述溶液移到37‑40℃的水浴中，加入去离子水，继续搅拌，反应停止后冷却到室温；C、将混合溶液移入到约90‑95℃水浴中，在搅拌的条件下继续反应，随后加入去离子水终止反应；再加入H₂O₂，搅拌条件下反应；最后加入HCl，经洗涤、真空干燥后即得到氧化石墨烯固体；(4)、取上述制备好的氧化石墨烯固体溶于超纯水中配制成溶液，随后向其中加入NaOH和一氯乙酸，在超声波条件下进行反应，使氧化石墨烯表面的羟基和环氧基变成羧基，经过滤、洗涤、真空干燥、称量、再溶解，得到羧基化的氧化石墨烯溶液；(5)、电化学传感器的构筑：A、 通过滴涂的方式将羧基化的氧化石墨烯修饰到玻碳电极上，在红外灯下烤干，作为基质材料；B、 将该电极在酰胺键活化试剂NHS/EDC中活化，并用去离子水洗涤；C、 然后将该电极浸入到抗体溶液中反应，接上抗体，接着用PBS缓冲溶液洗涤，除去表面物理吸附的物质；D、 用牛血清蛋白封闭溶液进行处理，消除非特异性结合的影响和封闭其余的活性位点；E、将电极浸入到不同浓度的Aβ寡聚体溶液中，通过抗体与抗原的特异性结合识别Aβ寡聚体；F、将该电极放入含有上述制备的AuNPs共轭物的溶液中培养，形成“三明治”型的类免疫传感器。