一种单克隆抗体药物糖基化修饰的质谱定量分析方法

摘要

本发明的一种单克隆抗体药物糖基化修饰的质谱定量分析方法，属于蛋白质组学的技术领域。选取Bevacizumab经胰蛋白酶水解后获得其糖基化修饰的某一特定糖肽H5N2，基于液相色谱‑串联质谱技术，利用平行反应监测模式对选取的特定糖肽进行扫描分析，建立特定糖肽稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。同时对复杂样品中的糖肽进行亲水富集，用同一方法进行定量分析。本发明可实现对单抗的特定糖型进行分析和定量，具有高通量、灵敏度高、重现性好等特点；所用试剂及药品较现有技术更廉价易得，且配制方法简单，利于方法推广；对蛋白类药物的糖基化修饰定性和定量研究具有指导借鉴意义。

主权项

一种单克隆抗体药物糖基化修饰的质谱定量分析方法，所述的单克隆抗体药物是贝伐珠单抗；按如下6个步骤进行血浆样品中特定糖肽的定量分析：(1)血浆样品的还原：于聚乙烯管中加入2μL大鼠的血浆样品，加入96μL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀；加入2μL还原剂，涡流混匀；60℃孵育1小时，得到反应液；(2)半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25℃避光孵育40min；(3)血浆样品的胰酶消化：经半胱氨酸封闭的反应液中加入700μL消化缓冲液，涡流混合，再加入3μL胰酶溶液，涡流混合，37℃孵育12～16h得到血浆样品酶解液，加入5μL甲酸终止反应；(4)血浆酶解液的固相萃取：于固相萃取柱中加入1mL乙腈溶液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完；取血浆样品的酶解液，至液体自然流完；于固相萃取柱中加入1mL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗；于固相萃取柱中加入1mL洗脱溶液，至液体自然流完，得血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；(5)血浆样品的浓缩、复溶：将上述步骤中得到的血浆样品洗脱液真空离心蒸干，加入100μL 0.1％甲酸，涡流混匀，得到血浆样品的复溶液；(6)血浆样品的质谱分析：取血浆样品复溶液2μL进行液相色谱‑串联质谱分析，记录色谱图，所选的特定糖肽的峰面积即代表其在血浆样品中的相对含量。