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一种衍生化测定酚类雌激素的方法,其特征在于包括以下步骤：(1)雌激素标准品的制备和测定①标准储备液的制备：将17β‑雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚6种雌激素固体标准品分别用甲醇溶解后，分别用甲醇配成浓度为1mg/mL的6种标准储备液，置于‑20℃冰箱储存；②五个系列浓度混合标准液的制备：量取步骤(1)①制备的浓度为1mg/mL的17β‑雌二醇标准储备液、浓度为1mg/mL的雌三醇标准储备液、浓度为1mg/mL的雌酮标准储备液、浓度为1mg/mL的己烯雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的己烷雌酚标准储备液、浓度为1mg/mL的双烯雌酚标准储备液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液，然后分取混合工作液用甲醇分别稀释为混合标准液A、混合标准液B、混合标准液C、混合标准液D、混合标准液E五个系列浓度混合标准液，其中：混合标准液A中含有的17β‑雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为5ng/mL；混合标准液B中含有的17β‑雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为50ng/mL；混合标准液C中含有的17β‑雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为100ng/mL；混合标准液D中含有的17β‑雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为500ng/mL；混合标准液E中含有的17β‑雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6个组分的浓度均为1000ng/mL；③内标的制备：将氘代17β‑雌二醇(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成浓度为1mg/mL的内标标准储备液，量取内标标准储备液，加入甲醇配制成浓度为500ng/mL的内标；④丹磺酰氯衍生试剂的制备：将固体丹磺酰氯溶解于有机溶剂，用该有机溶剂配制成浓度为1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于‑20℃冰箱储存；⑤分别取1mL步骤(1)②配制的五个系列浓度的混合标准液，在每一个混合标准液中加入步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标100μL，每一个混合标准液加入内标混合均匀后用氮气吹干，分别得到对应的五个混合标样；混合标准液A对应的混合标样记为混合标样A＇，混合标准液B对应的混合标样记为混合标样B＇、混合标准液C对应的混合标样记为混合标样C＇、混合标准液D对应的混合标样记为混合标样D＇、混合标准液E对应的混合标样记为混合标样E'；⑥衍生化反应和超高效液相色谱‑质谱检测器测定步骤(1)⑤所述的五个混合标样均按如下方法进行衍生化反应：每个混合标样中加入步骤(1)④制备的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂10～1000μL，用碳酸氢钠或氢氧化钠调pH为8.0～11.0，旋涡混合30s，在温度45℃～70℃，衍生化反应10～30min；每个衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱‑质谱检测器测定，超高效液相色谱‑质谱检测器测定条件如下：色谱柱：waters BEH C18 2.1×50mm。色谱柱温度：35℃。进样体积：10μL；流动相为甲醇:1mmol/L乙酸铵,设置梯度洗脱，梯度洗脱条件按表1：表1 梯度洗脱条件<img file="FDA0001008283010000021.GIF" wi="1550" he="379" />设置质谱检测器扫描方式：选择离子模式，按表2所示质谱检测器测定衍生产物的条件，正负离子同时扫描，扫描质量数范围为m/z＝40～600，锥孔电压15V，采样速率8点/秒,毛细管电压0.8kv；表2 质谱检测器测定衍生产物的条件<img file="FDA0001008283010000022.GIF" wi="1548" he="818" />⑦经超高效液相色谱‑质谱检测器测定得到17β‑雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚6种雌激素的峰面积和内标的峰面积，分别以6种雌激素的峰面积与内标峰面积之比值为纵坐标，步骤(1)②中的五个混合标准液的浓度值为横坐标，绘制对应的六个标准工作曲线；(2)待检样品检测①准确称取5g动物组织待检样品，加入100μL步骤(1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标，用25mL乙腈提取，5000rpm，离心5min，收集上清液，氮气吹干；②加入步骤(1)④所述的1mg/mL丹磺酰氯衍生试剂10‑1000μL后，用碳酸氢钠或氢氧化钠调pH为8.0～11.0，旋涡混合30s，在温度45℃～70℃，衍生化反应10～30min；③衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL甲醇溶液和1mmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱‑质谱检测器测定，按步骤(1)⑥所述的超高效液相色谱‑质谱检测器测定条件测定；④经超高效液相色谱‑质谱检测器测定，得到待检样品峰的保留时间和峰面积，与步骤(1)⑥所得的6种雌激素标样的保留时间进行比较，确定待检样品中所含雌激素的种类，与步骤(1)⑦中所对应的雌激素的标准工作曲线比较，得到所含雌激素的含量。 |
