微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法

摘要

微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，属于微生物制备技术，涉及一种以赭曲霉为菌种，坎利酮为底物，采取分批发酵技术制备11α羟基坎利酮的方法。本发明解决了微生物间歇补料法制备11α羟基坎利酮生产周期长、工艺复杂，转化过程中需补加碳源、氮源及抗生素，不仅成本高，而且由于转化过程中生物量不断增长，菌体甚至会暴露于空气中，给生产控制带来相当难度等问题。其技术方案是以赭曲霉为菌种，坎利酮为底物，经产孢和生产斜面制备、孢子悬液制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化的分批发酵技术制得。本发明工艺简单、转化时间短、染菌机率低、转化率高于90％，从而为大规模工业化生产奠定了基础，具有较大经济效益。

主权项

1、微生物分批发酵转化法制备11α羟基坎利酮的方法，其特征在于以赭曲霉为生产菌种，坎利酮为底物，经过产孢和生产斜面制备、孢子悬液制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化的分批发酵技术最终得到目标产物，具体方法如下：(1)产孢和生产用斜面制备生产菌种为赭曲霉，将该菌置于葡萄糖土豆汁斜面PDA培养基或小米斜面上，25-28℃恒温培养4-7天生成黄色孢子，覆盖在斜面上，颜色为灰黄色，于PDA斜面背面可以观察到红色色素，然后转接在酵母膏大豆蛋白胨葡萄糖斜面培养基YPDA斜面上，25～28℃培养7-10天，生成金黄色孢子，即生产用斜面，于4℃冰箱中保藏，保藏时间在20天以内；(2)孢子悬液制备将5m12％吐温80溶液加入生产斜面中，洗下孢子，计数调整孢子悬液浓度为4-8×108个/100ml；(3)一级种子培养种子培养基由碳源、氮源组成，用10％H3PO4(w/v)调节pH5.0～6.0，120～125℃灭菌15～25min，每100ml种子培养基接入1ml孢子悬液，在摇床转速150-200r/min下，25-30℃培养18～24h即得到适于接种的种子培养物；(4)二级发酵培养发酵培养基由碳源、氮源、磷源组成，用10％HCl(w/v)调节pH4.0～6.0，120～125℃灭菌15～25min，将生长良好的种子培养液按2％～5％(v/v)的接种量接入到发酵罐中，在发酵过程中初始转速为100～200r/min，通气量为70～100L/h，罐压为0.05～0.1Mpa，培养温度25～28℃，通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平保持在20％～30％，培养18-22小时后，残糖降至10-14g/L时，即得适宜于转化的菌体培养液；(5)底物的转化·发酵采用干粉投料，将底物进行预处理，底物要预先粉碎，要求粒度小于100μ，于50～100℃烘4h，投料量10～20g/L，在转化过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在10～30％，转化60-70h；·检测转化60h之后，通过薄层层析TLC和高效液相HPLC检测其转化率，其中TLC方法分析时，选用展开系统为苯∶丙酮＝3～5∶1～4或氯仿∶乙酸乙酯＝2～4∶1～5，HPLC分析时选用C18柱，检测波长为280nm，选用70-90％甲醇水或乙腈水作为流动相，当转化率高于90％后放罐。