平邑甜茶无融合生殖MhSERK1基因植物表达载体构建方法

摘要

本发明公开了平邑甜茶无融合生殖MhSERK1基因植物表达载体构建方法与应用，本发明所构建的表达载体pBI121‑MhSERK1是由MhSERK1基因插入到PGM‑T，经XbaI和SmaI双酶切后连接到pBI121的XbaI和SmaI位点得到的重组质粒。该植物表达载体用于植物遗传转化，MhSERK1在CaMV35S启动子的启动下表达，对植物的生殖发育过程产生调控作用，使植物不经过生殖细胞的融合可以正常产生种子，达到无融合生殖的作用。

主权项

苹果属平邑甜茶无融合生殖相关MhSERK1基因植物表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（一）平邑甜茶无融合生殖MhSERK1基因的克隆：1.1总RNA的提取及反转录成cDNA：1.2设计引物扩增MhSERK1：上游引物MhSERK1‑F：5’‑GGATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT‑3’下游引物MhSERK1‑R：5’‑ACTTACCTTGGACCGGATAACT‑3’以提取的平邑甜茶子房cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系：25μL体系，取1μL cDNA加入Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR Buffer2.5μL，2.5mmol·L^‑1 dNTPs2.0μL，正反向引物各1μL，最后用水补足到25μL；反应程序：95℃5min；94℃40s，60℃40s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min；PCR扩增产物经浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳发现特异条带，用AXYGEN凝胶回收试剂盒回收纯化，用T₄DNA连接酶将回收产物连接至pGM‑T载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，经PCR筛选，进行序列测定；（二）植物表达载体pBI121‑MhSERK1的构建2.1引物设计：根据目的基因MhSERK1核苷酸序列设计上下游引物，分别引入XbaI的TCTAGA和SmaI的CCCGGG酶切位点，引物为：上游引物MhSERK1‑XbaI：5’‑GGTCTAGAATGGAGAGAAAGGTTGGGAAT‑3’下游引物MhSERK1‑SmaI：5’‑ACCCCGGGTTACCTTGGACCGGATAACTC‑3’2.2PCR扩增：以（一）中的cDNA第一链为模板，引物MhSERK1‑XbaI和MhSERK1‑SmaI做PCR扩增：体系为25μL：取1μL cDNA加入Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR Buffer2.5μL，2.5mmol·L^‑1dNTPs 2.0μL，正反向引物各1μL，最后用无菌水补足到25μL；反应程序：95℃5min；94℃40s，60℃40s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min；2.3电泳：将2.2扩增的PCR产物经1%浓度的琼脂糖凝胶电泳发现特异条带，与预期结果相符；2.4将2.2中PCR产物电泳后用DNA纯化回收试剂盒回收特异条带并连接至PGM‑T载体得到重组载体PGM‑T‑MhSERK1，然后转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，XbaI和SmaI双酶切的MhSERK1片段与XbaI和SmaI双酶切的pBI121连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证；2.5将2.4中含重组载体PGM‑T‑MhSERK1的阳性菌液进行培养，提取菌液中的重组质粒PGM‑T‑MhSERK1；将含有植物表达质粒pBI121的菌种扩大培养，提取质粒pBI121，将提取的PGM‑T‑MhSERK1质粒和pBI121质粒分别用XbaI和SmaI限制性内切酶双酶切，酶切后琼脂糖凝胶电泳检测条带，并切下PGM‑T‑MhSERK1质粒的小片段和pBI121质粒的大片段，利用胶回收试剂盒回收；用T4DNA连接酶连接小片段和大片段过夜连接，然后利用热激法转化感受态细胞TOP10；PCR筛选阳性克隆，再进行测序验证，得到序列完全正确的重组表达载体pBI121‑MhSERK1及含该重组表达载体的大肠杆菌；其中，连接体系为：小片段2.7μL，大片段7μL，T4DNA连接酶1μL，10×Buffer1.5μL，ddH₂O补足至15μL；2.6pBI121‑MhSERK1重组质粒转化农杆菌：从2.5中含pBI121‑MhSERK1载体的菌株中提取重组质粒，用冷激法转化农杆菌EHA105，转化方法为：①取10μL质粒DNA，加入30‑100μL农杆菌EHA105感受态细胞，充分混匀，冰浴5min，转入液氮冷冻1min；②迅速转入37℃水浴5min后，加入800μL YEP液体培养基；③28℃，150rpm预培养4‑5h，然后涂布于含有50mg·L^‑1Kan、50mg·L^‑1Rif的YEP平板，28℃培养48h后可出现菌落；④挑取菌体做PCR鉴定，确定正确后保存于‑70℃，即为植物遗传转化的工程菌株；其中，所述液体培养基为：称取胰蛋白胨1g，酵母浸粉1g，NaCI0.5g，融解于100mL无菌水中，经高温高压灭菌备用；（三）植物表达载体pBI121‑MhSERK1的遗传转化3.1将2.6中冻存的农杆菌EHA105菌液在含有50mg·L^‑1利福平pH=7.0的YEP固体培养基上涂板培养，28℃倒置培养48h；3.2待培养基上长出菌斑，挑取农杆菌EHA105单菌落接种于含有50mg·L^‑1Rif pH=7.0的 YEP液体培养基中，28℃，200rpm·min^‑1振荡培养过夜 16‑20 h；3.3用移液枪按1：50的体积比接种于50mL含有50mg·L^‑1Rif pH=7.0的YEP 液体培养基中，28℃，150rpm·min^‑1振荡培养；3.4当震荡培养液体OD600达到0.5时，用1.5mL离心管取1.5mL摇好的菌液，冰上冷却10min，5000rpm·min^‑1离心5min；3.5弃上清液，收集菌体，加入1.5mL的冰预冷的25mM CaCl₂溶液重悬沉淀，冰上放置20 min至4℃离心机5000 rpm·min^‑1离心5min；3.6弃上清液，每管加入50μL预冷的25mM CaCl₂溶液重悬沉淀，冰上放置20min后使用，剩余的感受态细胞在液氮中速冻后于‑80℃超低温冰箱中保存；3.7取载体pBI121‑MhSERK1质粒DNA10μL加入30‑100μL所述的EHA105感受态细胞，用枪尖轻轻吹打均匀混合，放于冰盒冰浴5min；转入液氮冷冻1min，将离心管迅速置于37℃水浴5min，再迅速冰浴2min，然后将其加入800 uL pH=7.0的YEP液体培养基，28℃，160rpm·min^‑1震荡培养4‑6h，离心后剩约100μL菌液涂布于含50mg·L^‑1Rif和50mg·L^‑1Kan pH=7.0的YEP固体培养基中，28℃倒置培养48h，出现菌斑；挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于普通烟草叶片的遗传转化；3.8普通烟草叶片浸染①将继代15‑20d的普通烟草组培苗取出，剪取烟草新萌发的幼嫩叶片，去除叶脉，剪成0.5×0.5cm叶片置于悬浮培养液中浸染备用；②将步骤2.6中制备好的已转化含有重组质粒的pBI121‑MhSERK1的农杆菌菌液扩大培养，放入含有10mLYEP液体培养基的离心管中，28℃，150‑200rpm/min摇菌15‑20h，按照菌液浓度进行稀释，加入10 mL的含有50 mg^.L^‑1Kan的YEP液体培养基中，28℃，150‑200rpm振荡培养4‑6h，至菌液浓度OD=0.4‑0.6；所述YEP液体培养基含有50mg.L^‑1Kan+50mg.L^‑1Rif；③将悬浮液中的叶片放入农杆菌菌液中进行浸染8‑10min，用灭菌的滤纸将多余的菌液吸净，将叶片置于培养基MS+6‑BA1.0mg.L^‑1+NAA0.1mg.L^‑1上共培养3d；④共培养3d后，将浸染的烟草叶片用悬浮液进行清洗，然后用无菌滤纸吸干多余农杆菌菌液，再置于筛选培养基MS+6‑BA1.0mg.L^‑1+NAA0.1mg.L^‑1+Kan100mg.L^‑1+Cef500mg.L^‑1上，黑暗条件下进行筛选培养；⑤1个月后，在浸染的叶片上长出愈伤组织，当叶片边缘出现抗性芽后，再将抗性芽转移到新的增殖培养基MS+Kan100mg.L^‑1+Cef500mg.L^‑1中进行增殖培养，至得到T₀代转化植株；（四）植物表达载体pBI121‑MhSERK1的遗传转化烟草抗性植株的基因功能验证待抗性苗长至5～7片叶时，选用基因组试剂盒提取抗性烟草植株叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，做PCR检测验证是否为转基因烟草，反应体系为25μL：体系为上下游引物MhSERK1‑XbaI和MhSERK1‑SmaI各1μL，ExTaq2.5μL，2.5mmol L^‑1 dNTP 2μL，DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL；PCR反应程序为：95℃5min，94℃40s，58℃40s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；PCR结束后，用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测为阳性；将该MhSERK1基因转入普通烟草植物受体系统后，当根系长至5‑7条时，进行炼苗3‑5天，然后将抗性苗移栽到土中，用塑料薄膜覆盖以保湿，放入大棚中遮阴培育；经过2‑3月培育T0代转化抗性株系后，烟草植株逐渐产生花蕾，在花蕾即将开放前将一部分烟草抗性植株采取去雄处理；未转化烟草对照植株采取去雄处理；经过一段时间生长发育后对处理植株进行观察发现：采取去雄处理的烟草抗性植株可以正常结种子，而对照未转化烟草植株经过去雄处理后未能结种子。