河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明是一种用于河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，其组成为：反应液A，1支，其组成为：10×Lampbuffer，dNTP，硫酸镁水溶液，甜菜碱水溶液，引物Vaes‑F3、Vaes‑B3、Vaes‑FIP、Vaes‑BIP，Bst DNA酶，10×荧光染料SYBR GreenⅠ，阳性对照试样，阴性对照试样和超纯水。本发明还涉及应用该试剂盒进行检测的方法。本发明试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低、操作方法更简单，适于水产养殖场现场快速检测。本发明方法解决了现有技术时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂、需要复杂仪器等缺陷，为水产动物疾病检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对河口弧菌引起的疾病的现场检测的迫切需要。

主权项

一种河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测方法，其特征在于，该方法应用河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒进行检测，所述试剂盒的组成为：(1)反应液A，1支，其体积百分比组成为：①10×Lampbuffer，14.9％；其中Lampbuffer的组成为：200mM Tris‑HCl，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgSO₄，质量浓度1％的Trition X‑100，Lampbuffer的pH为8.8；②dNTP，13.5％，浓度为10mM；③硫酸镁水溶液，22％，浓度为25mM；④甜菜碱水溶液，22％，浓度为8mol/L；⑤Vaes‑F3，2.8％，浓度为10uM，上游外部引物Vaes‑F3为：GACC CAGC AACA GATT GG；⑥Vaes‑B3，2.8％，浓度为10uM，下游外部引物Vaes‑B3为：TCGT TAGT CCAG ATCG AATG；⑦Vaes‑FIP，11％，浓度为10uM，上游内部引物Vaes‑FIP为：ACAG ACGA CCAC CAGT AACC‑GTGG GCAT TGGA TGAA CA；⑧Vaes‑BIP，11％，浓度为10uM，下游内部引物Vaes‑BIP为：ACAG CGTT GTGA AGAG ACAC T‑CCTA TTGT CTGC TGCG AA；(2)反应液B：8000U的Bst DNA酶，1支；(3)反应液C：10×荧光染料SYBR Green Ⅰ，1支；(4)河口弧菌基因组DNA的阳性对照试样，1支；(5)健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，1支；(6)超纯水，1支；所述河口弧菌的环介导恒温扩增快速检测方法步骤如下：(1)DNA抽提：取1mL待检样品增菌液12000r/min离心1min，弃上清，将菌体悬浮于100μL的灭菌蒸馏水中，100℃煮沸10min，冰浴中冷却后12000r/min离心10min，取上清作为PCR模板DNA；(2)LAMP扩增：向反应管中加入反应液A 18μL，超纯水5μL，模板DNA 1μL，95℃水浴5min，冷却；再加入反应液B 1μL；63℃孵育60min，80℃灭活10min；同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用健康鱼组织总DNA的阴性对照试样，阳性对照采用河口弧菌基因组DNA的阳性对照试样；(3)显色检测：再向反应管中加入反应液C 1μL；观察显色结果，显绿色的为河口弧菌阳性，显粉色的为河口弧菌阴性。