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一种MST1和磷酸化MST1作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)细胞培养将人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含有10％FBS和青链霉素双抗的DMEM/F12培养液中，待细胞长至90％汇集时，用质量体积比为0.25％胰酶细胞消化液常规消化传代，在37℃、5％CO<sub>2</sub>、饱和湿度中培养；(2)免疫印记实验步骤(1)处理的Ishikawa或HEK293T细胞经预冷的PBS漂洗后，加入细胞裂解缓冲液，刮取收集细胞，4℃旋转裂解30min；12000g离心30min后收集上清；经Bradford法测定蛋白质浓度后，取总蛋白进行10％ SDS‑PAGE胶电泳分离，并按常规方法转印至PVDF膜上，加入以下相应抗体：anti‑Myc‑HRP,anti‑Flag‑HRP,anti‑MST1,Phospho‑MST1(Thr183),anti‑phosphothreonine,anti‑phosphoserine,anti‑HOXA10,anti‑β‑actin,anti‑GAPDH，进行相关蛋白表达与磷酸化修饰检测；(3)免疫共沉淀HEK293T细胞长至80％汇集后，采用脂质体FuGENE 6将Myc‑HOXA10和/或Flag‑MST1 cDNA转入HEK293T细胞，48小时后收集细胞总蛋白，分别与c‑Myc Beads和/或Flag M2Beads4℃缓慢摇动孵育过夜，Beads经预冷的RIPA buffer洗3次，每次5分钟后，离心收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃加热5分钟，离心，取上清进行10％ SDS‑PAGE电泳，蛋白经转移至硝酸纤维素膜上后按Western blotting常规操作进行分析蛋白间相互作用情况；Ishikawa细胞总蛋白经ProteinA/G agarose 4℃缓慢旋转孵育2h，5000g、4℃离心1min后收集上清，分别加入HOXA10抗体与Rabbit IgG，4℃缓慢旋转孵育4h后，再加入ProteinA/G，在4℃缓慢旋转孵育过夜，次日5000g、4℃离心1min收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5分钟，冰上静置5min，离心后取上清进行10％ SDS‑PAGE胶电泳分离，按照常规方法转印到PVDF膜上，加入Anti‑MST1抗体进行MST1蛋白检测，以明确Ishikawa细胞中MST1与HOXA10相互结合情况；(4)免疫组织化学收集临床病人分泌中晚期子宫内膜组织，固定并石蜡包埋；石蜡切片常规脱蜡至水，经EDTA抗原修复后；PBST漂洗3次，每次5min，滴加3％H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>‑纯甲醇溶液,37℃30min灭活内源性过氧化物酶；PBST漂洗3次，每次5min，滴加5％山羊血清37℃封闭30min；甩去多余的液体，滴加1:100稀释的兔抗MST1抗体和Phospho‑MST1(Thr183)抗体，4℃孵育过夜，PBST漂洗3次，每次5min,滴加1:400生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30min；PBST漂洗4次，每次5min，按DAB显色试剂盒所述方法进行显色，室温显色5–15min后蒸馏水洗涤终止显色，脱水、透明、封片后于显微镜下进行观察人子宫内膜组织中MST1及磷酸化MST1的细胞定位及表达改变情况并拍照；(5)染色体免疫共沉淀(ChIP)/PCR分析MST1对HOXA10转录活性的调节(6)人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验利用人绒毛膜癌BeWo细胞系建立体外细胞球培养体系作为体外胚胎粘附于内膜细胞单层上的模型。 |
