一种检测新城疫病毒变异株的单克隆抗体1E5

摘要

本发明提供一种检测新城疫病毒变异株的单克隆抗体1E5：大体步骤是：通过以纯化的新城疫病毒NDV LaSota株为免疫原，免疫8周龄BALB/C小鼠，最后加强免疫后3天取小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0融合。以纯化的NDV LaSota株为抗原包被酶标板用于阳性杂交瘤细胞的筛选，经ELISA检测阳性的单克隆1E5进行3次亚克隆后，注射致敏的8－10周龄BALB/C小鼠腹腔制备腹水。单抗生物学活性鉴定结果表明，单抗1E5腹水ELISA效价为100×2¹⁰，免疫球蛋白亚类为IgG2a，HI效价为14log2，对NDV标准强毒株F48E8的细胞中和效价为320。本发明的单抗可用于新城疫病毒的抗原变异研究，以进行新城疫疫情监测与预报，为新城疫的有效防控提供科学的理论依据。

主权项

1.一种检测新城疫病毒变异株的单克隆抗体1E5，其特征在于以纯化的新城疫病毒(NDV)LaSota株为免疫原，免疫8周龄BALB/C小鼠，最后加强免疫后3天取小鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞融合，以纯化的NDV LaSota株为抗原包被酶标板用于阳性杂交瘤细胞的筛选，经ELISA检测阳性的单克隆1E5进行3次亚克隆后，注射致敏的8-10周龄BALB/C小鼠腹腔制备腹水，通过对单克隆抗体生物学活性鉴定结果表明，单克隆抗体1E5腹水ELISA效价为100×210，免疫球蛋白亚类为IgG2a，HI效价为14 log2，对NDV标准强毒株F48E8的细胞中和效价为320；具体制备步骤如下：1)动物免疫以纯化的NDV LaSota株为免疫原，免疫6-8周龄BALB/C小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂充分乳化的病毒抗原腹腔注射6-8周龄的BALB/C小鼠，抗原量为50ug/只；两周后用弗氏不完全佐剂乳化的相同抗原量二次免疫，两周后用不加佐剂的相同抗原量腹腔注射加强免疫，3天后融合；2)融合取免疫BALB/C小鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞进行融合，融合剂为PEG4000，昆明小鼠腹腔细胞作为饲养细胞，选择性培养基为HAT，融合后分装96孔细胞培养板，置于CO2培养箱培养，7-10天后用HT换出HAT，每天观察，当杂交瘤细胞长至孔底面积1/10时吸出上清检测；3)阳性杂交瘤细胞的筛选和建株阳性克隆的筛选采用间接ELISA，阳性克隆按有限稀释法亚克隆三次，最后挑选反应较强的单克隆扩大培养并作为建株细胞；4)单克隆抗体腹水的制备8-10周龄BALB/C小鼠腹腔注射无菌液体石蜡0.5ml/只，7天后腹腔注射处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞50万/只，每天观察至小鼠腹部明显膨大，抽取腹水并离心后取上清，-20℃保存备用；5)单克隆抗体1E5特异性鉴定选用SPF鸡胚尿囊液、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒包被96孔酶标板，间接ELISA鉴定单克隆抗体特异性；6)单克隆抗体间接ELISA效价测定以纯化的NDV LaSota株包被96孔酶标板，1％BSA封闭，单抗1E5腹水1：100稀释后再进行2倍倍比稀释至100×212；7)单克隆抗体血凝抑制(HI)特性鉴定：按常规方法进行；首先以NDV LaSota为HI抗原，测定单克隆抗体1E5的HI效价，再分别以不同NDV毒株为HI抗原，进行HI试验；8)单克隆抗体中和特性鉴定：采用细胞中和试验进行，具体方法如下：病毒细胞半数感染量(TCID50)的测定：取9-11日龄SPF鸡胚，按常规方法制备鸡胚成纤维细胞CEF，细胞记数后稀释为80万/ml的细胞悬液，分装96孔细胞培养板，37℃培养24h，取NDV各毒株病毒液用无血清DMEM基础液10倍倍比稀释，分别取10-3-10-108个稀释度接种CEF，50ul/孔，每个稀释度接种5孔，同时设空白对照，37℃培养72h，取细胞培养液测定HA效价，以HA≥2log2判为感染，按Reed—Muench法计算各毒株的TCID50；细胞中和试验：单抗1E5无菌处理后用PBS以1：10稀释，分别与等体积的200TCID50病毒液混合，37℃作用45min，接种培养24h的CEF，37℃培养72h，取细胞培养液测定HA效价，以HA≥2log2判为感染；