一种获得柳枝稷转基因植株的方法

摘要

本发明公开了一种采用农杆菌介导法转化获得柳枝稷转基因植株的方法。在进行柳枝稷遗传转化时，以灭菌后萌动的种子为转化受体，采用农杆菌转化和共培养；在筛选培养基SMBP1，SMBP2和SMBP3上依次进行筛选获得抗性芽；将抗性芽在生根培养基SMO中培养成苗；移栽至温室或大田进行分子生物学方法检测，根据分子生物学方法和目标性状筛选获得含有外源目的转基因植株。本发明建立的柳枝稷的转基因方法，克服了农杆菌介导法对组织培养条件依赖性强的缺点，拓宽了遗传转化的基因型范围，简化了转化程序，为利用转基因技术对柳枝稷进行遗传改良提供了一条新的途径。

主权项

1.一种获得柳枝稷转基因植株的方法，其特征在于，该方法以萌动的种子为转化受体，采用农杆菌介导法转化获得柳枝稷转基因植株，具体按如下步骤进行：步骤一：种子的灭菌取柳枝稷的成熟种子，用3％浓度的次氯酸钙进行灭菌，其中次氯酸钙中加入0.1％的吐温80，4℃条件下暗培养12小时，再用3％的次氯酸钙二次灭菌；步骤二：种子的萌动将种子在无菌滤纸上，24℃条件下，暗培养至种子萌动；步骤三：农杆菌转化和共培养挑取农杆菌的一单克隆于含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，在28℃条件下，以200rpm/分钟～250rpm/分钟培养1～2天，至农杆菌菌株浓度为OD600＝0.8～1.0，LB培养基为：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，pH为7.0；在LB培养基中加入乙酰丁香酮继续培养1小时～2小时，然后转入无菌的50mL离心管中，常温下，以3500rpm/分钟离心15分钟收集农杆菌，以液体MBP培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为OD600＝0.5，其中，液体MBP培养基为：MS无机盐和维生素的混合合成物：4.43g/L、麦芽糖：30g/L、6-苄基氨基嘌呤：3mg/L、pH＝5.8；沿种子中部横向劈开，弃去不含胚根的半粒种子，加入悬浮好的农杆菌菌液，同时加入乙酰丁香酮，在真空台上抽真空60～90分钟后，常温下，以50rpm/分钟～60rpm/分钟培养60～90分钟；弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去种子表面残留的菌液，然后将种子转入培养基MBP，在20℃～24℃条件下，暗培养2～3天，其中，MBP培养基为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；步骤四：抗性芽的筛选将种子依次转入筛选培养基SMBP1，SMBP2和SMBP3中，24℃条件下，依次光照培养2～3星期，获得抗性芽；其中，筛选培养基SMBP1为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素100mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；筛选培养基SMBP2为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素75mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；筛选培养基SMBP3为：MS无机盐和维生素的混合合成物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、潮霉素50mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；步骤五：抗性苗的生根培养在抗性芽生长1cm～2cm高时，转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养3～4星期，至幼苗植株高度为5cm以上，其中，生根培养基SMO为：MS无机盐和维生素的混合合成物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8；步骤六：移栽至温室或大田进行分子生物学方法检测在幼苗植株4～6叶期，取叶片进行PCR和GUS检测，根据前期检测结果，在幼苗植株生长至6-8叶期时，对PCR检测阳性植株进行Southern杂交，获得含有目标基因的转化植株；步骤七：目的基因表达的转基因植株的获得根据目的基因表达时期不同，对Southern杂交检测阳性植株在相关时期进行RT-PCR、Nouthern杂交和Western杂交检测，同时根据目标性状，筛选获得目的基因表达的转基因植株。