用人胚肺二倍体细胞培养繁殖脊髓灰质炎病毒的方法

摘要

本发明提供一种用人胚肺二倍体细胞KMB17培养脊髓灰质炎病毒的方法，其特征在于取人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17或者人二倍体成纤维细胞2BS的第10～40代，并将单层细胞分散并悬浮于培养液中，静置培养至长成致密单层，用含血清的培养基将细胞收集，加入脊髓灰质炎病毒毒种进行悬浮吸附，补加含血清的营养液，静置培养，换成无血清培养液，细胞出现病变时，收获细胞，经冻存、化冻、合并、检测感染性滴度后，得生产疫苗用的脊髓灰质炎病毒液。本发明可使病毒与细胞受体充分接触，有利于病毒进入细胞，同时使细胞处于分裂状态，有利于病毒繁殖，不仅提高了产量，而且显著提高了脊髓灰质炎病毒的滴度，与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度相比无显著差异(P＞0.05)。

主权项

1、一种用人胚肺二倍体细胞KMB17或者人二倍体成纤维细胞2BS培养脊髓灰质炎病毒的方法，包括细胞培养、悬浮吸附培养，病毒培养，其特征在于经过下列具体工艺步骤：A、取人胚肺二倍体细胞KMB17或者人二倍体成纤维细胞2BS的第10～40代，用0.03～0.05％胰蛋白酶+0.02～0.04％乙二胺四乙酸EDTA将单层细胞分散并悬浮于培养液中，接种于容器中，35～37℃静置培养至长成致密单层；B、将长成致密单层的KMB17细胞或者2BS细胞弃营养液，消化后，用含2～5％血清的培养基MEM将细胞收集于另一容器内，记数，按0.03～0.05感染复数的量加入脊髓灰质炎病毒毒种，在33±0.5℃下，放入转速为20-120转/分钟的搅拌器上搅拌，进行悬浮吸附0.5～2.0小时；C、将悬浮吸附好的悬液分装于培养瓶内，补加含5％～10％血清浓度的营养液至每个培养瓶并使终体积为100～200ml，于33±0.5℃静置培养20～24小时，换成无血清培养液，培养至90小时，细胞出现病变时，即收获细胞并于-20～-30℃冻存，24小时以后化冻，合并样品、检测感染性滴度后，即得生产疫苗用的脊髓灰质炎病毒液。