人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法

摘要

本发明涉及一种人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法。目前的细胞库制备过程均采用小牛或者胎牛血清进行培养、消化、冻存等过程，因此，在未来的临床脐带干细胞应用中的确会存在异种蛋白的残留风险。本发明组成包括:脐带血富血小板血清的制备，血小板裂解液的制备，去血小板血清的制备，血小板裂解液中的细胞因子PDGF‑AB，FGF2,TGF‑β，VEGF含量的确定，脐带干细胞的分离和原代培养，脐带干细胞的培养及传代，脐带干细胞冻存，染色体核型分析。本发明用于培养干细胞。

主权项

一种人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：其步骤为：脐带血富血小板血清的制备，血小板裂解液的制备，去血小板血清的制备，血小板裂解液中的细胞因子PDGF‑AB，FGF2, TGF‑β，VEGF含量的确定，脐带间充质干细胞的分离和原代培养，脐带间充质干细胞的培养及传代，脐带间充质干细胞冻存，染色体核型分析，培养后脐带间充质干细胞的特征分析；所述的脐带血富血小板血清的制备：采血袋或采血管中采用2000~5000UI 的肝素作抗凝剂，采集的脐带血50~120ml 分装在50ml 无菌离心管中，在4~30 度温度下，150~220g 离心5~25 分钟，上层为富含血小板血清，上层的血清占总体积的40%；所述的血小板裂解液的制备：将富血小板血清移至新的无菌离心管中，采用Sysmex hematology analyzer (KX‑21) 对血清中所含血小板数量进行计数，将血清置于‑80 度冰箱冻存2~24 小时；冻存后的含血小板血清在37 度快速复苏后，经800~1200g 离心5~30 分钟，去除细胞碎片，上清液即为血小板裂解液，用于自体脐带间充质干细胞的培养；所述的去血小板血清的制备：脐带血离心分离获得上层富血小板血清的过程后，对留在离心管中的中层有核细胞和下层红细胞以800g~1000g 速度离心30~40分钟，上层清亮的血清层即为去血小板血清；所述的血小板裂解液中的细胞因子PDGF‑AB，FGF2, TGF‑β，VEGF含量的确定：采用R&D 系统的酶联免疫（ELISA）试剂盒进行检测，脐带血血小板裂解液中的营养因子分析如下所述：血小板数量是（530±58）×10⁶/ml，FGF2含量是204±35pg/ml，TGF‑B含量是92257±4879pg/ml，VEGF含量是650±86pg/ml，PDGF‑AB含量是191000±29010pg/ml；所述的脐带间充质干细胞的分离和原代培养：足月胎儿脐带取15~20cm 长，经过生理盐水和75% 酒精清洗后，剪成小段，分别将动脉和静脉剥离，将中间的华通氏胶分离出来，在无菌条件下解剖成0.2~2mm 小组织块，直接在细胞培养瓶中培养；或经过0.1%~0.2% 胶原酶37 度下消化1 小时，获得单细胞悬液，计数调节细胞浓度，然后接种于无菌培养瓶中，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养；采用基础培养基DMEM 加自体血小板裂解液进行培养；所述的脐带间充质干细胞的培养及传代：原代培养每3~5 天换液一次，当脐带间充质干细胞生长融合度达到80% 时，将细胞培养液收集，200g 离心后，上清液备用；培养瓶中的细胞经过无钙镁离子的无菌PBS 冲洗两次，用0.25% 胰酶37 度消化2~3 分钟，待细胞呈现圆形并逐步脱离培养瓶底部后，将上述备用细胞培养上清液倒入消化的培养瓶中，终止胰酶反应；用移液管轻轻吹打消化后的脐带间充质干细胞并收集，200g 离心5 分钟，将收集的细胞重新接种到新的培养瓶中进行扩增，直至达到预期的细胞数量；所述的脐带间充质干细胞冻存：冻存液的主要成分包括基础培养基5~10% 的DMSO 以及去自体血小板血清；采用胰酶消化办法，将脐带间充质干细胞从培养瓶中消化下来，以10⁶个干细胞/ml 浓度悬浮于上述冻存液中并将细胞悬液放置在2.0ml 冻存管中，冻存管在异丙醇为介质的程序冻存盒中逐渐降温到‑80 度，然后置于‑150度液氮气相环境中长期保存；所述的染色体核型分析：细胞有丝分裂中期染色体标本制备中，秋水仙素处理、低渗处理、固定、制片、Giemsa 染液染色后镜下阅片分析；所述的间充质干细胞为自体脐带来源的间充质干细胞，所述的间充质干细胞分离方法包括胶原酶分离法或组织块分离法；所述的间充质干细胞培养中，自体富血小板血清中含血小板浓度0.5~1×10⁹/ml，血小板裂解液在培养基中的比例为5~20% ；所述的间充质干细胞传代过程中，采用带自体血清的培养基进行胰酶中和作用；所述的间充质干细胞冻存液中包括5~10% 自体无血小板脐带血血清。