一种体内检测CAR-T细胞数的方法

摘要

本发明公开了一种体内检测CAR‑T细胞数的方法，包括如下步骤：(1)构建标准品，步骤如下：针对CAR‑T细胞的靶点基因设计特异性引物；使用PCR技术扩增出相应靶点基因特异性片段，并连接重组到T载体中；将重组质粒转化到大肠杆菌中进行表达扩增，纯化和测序鉴定；根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品，对待测样本进行绝对定量；(2)待测样本处理，步骤如下：抽提样本的全基因组；检测待测样本基因组的浓度和纯度；运用荧光定量PCR仪，上机检测样本中目的基因的具体拷贝数；(3)数据处理。本发明操作方便，测量结果精确，通过定期抽取患者全血或骨髓，可获知CAR‑T细胞在体内的变化情况，对患者进一步细胞治疗方案提供依据。

主权项

一种体内检测CAR‑T细胞数的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建标准品，步骤如下：S1、针对CAR‑T细胞的靶点基因设计一对特异性引物；S2、通过普通PCR扩增出相应片段，运用T载体构建出一个新的克隆质粒；S3、将新的克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；S4、根据质粒的浓度和分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品，对待测样本进行绝对定量；其中，拷贝数计算公式为：拷贝数＝6.02×10²³×核酸浓度÷(DNA length×660)；拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml；(2)待测样本处理，步骤如下：S1、抽提样本的全基因组；S2、检测待测样本基因组的浓度和纯度；S3、运用荧光定量PCR仪，上机检测样本中目的基因的具体拷贝数；(3)数据处理将荧光定量PCR仪得到的目的基因的具体拷贝数换算得出每微克中含目的基因的拷贝数，进而得出CAR‑T细胞的数量。