人神经营养素－3受体基因重组腺病毒构建方法

摘要

本发明涉及一种用人神经营养素-3受体基因(人TrkC基因)重组的腺病毒表达载体的构建方法及其应用。本发明的基本方案包括：引物设计合成，RT-PCR过程，克隆穿梭载体pShuttle-TrkC的构建及鉴定，重组腺病毒载体pAdeno-TrkC的构建及鉴定，293细胞包装，重组腺病毒的鉴定，人神经营养素-3受体基因重组腺病毒表达载体的生物学活性检测等步骤。本发明的优点在于选择一种基因重组腺病毒表达载体来促进受损伤的中枢神经元存活及其轴突再生，以及促进神经干细胞更多地分化为神经元，替换受损伤的神经元或死亡的神经元。

主权项

1.一种人神经营养素-3受体基因重组腺病毒构建方法，其特征是，该方法包括：(1)引物设计合成：从GenBank检索人神经营养素-3受体基因TrkC，针对基因全长设计两端引物；(2)RT-PCR过程：先将来源于人脑的mRNA进行反转录，反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果；(3)克隆穿梭载体pShuttle-TrkC的构建及鉴定：取RT-PCR反应液，0.8％琼脂糖凝胶电泳后，割胶纯化目的基因TrkC片断；连接纯化TrkC基因和线性化的pShuttle，将产物扩增并提取质粒，再测序鉴定质粒中目的基因的序列；(4)重组腺病毒载体pAdeno-TrkC的构建及鉴定：将pShuttle-TrkC与腺病毒骨架质粒连接，常规方法转化后进行扩增并提取质粒，并测序鉴定；(5)293细胞包装：pAdeno-TrkC用脂质体介导转染HEK293细胞，转染后第10天出现293细胞病变；收集病变细胞于-80℃和37℃反复冻融3次获得病毒粗裂解液，并反复感染293细胞扩增病毒；(6)重组腺病毒的鉴定：①PCR鉴定：抽提病毒DNA为模板，以目的基因的上、下游引物进行PCR鉴定；②RT-PCR鉴定：人神经营养素-3受体基因重组腺病毒感染293细胞后收获细胞，用Trizol试剂提取总RNA进行反转录；反应结束后，取反应液5ml于1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果；③免疫细胞化学染色：将步骤(5)中得到的病毒粗裂解液感染体外培养的神经干细胞球，用免疫细胞化学染色证实是否有入神经营养素-3受体基因重组腺病毒转染；和④Western blot：粗裂解的人神经营养素-3受体基因重组腺病毒液感染神经干细胞24小时后，裂解细胞做Western blot证实是否有TrkC表达；(7)人神经营养素-3受体基因重组腺病毒表达载体的生物学活性检测：体外培养绿色荧光小鼠海马的神经干细胞，观察神经营养素-3和神经营养素-3受体对体外培养的神经干细胞诱导分化的影响。