一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法

摘要

本发明提供了一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，包含粗纯工艺和精纯工艺，粗纯工艺为：将由重组DNA技术所得的rhTRAIL工程菌经扩大培养发酵所收集的菌体进行高压匀浆破碎、高速离心分离、微滤处理；精纯工艺为：将上一步粗纯工艺所得的粗纯样进行离子层析、疏水层析、凝胶过滤层析、浓缩，最终得到符合质量要求的样品。本发明工作周期短，回收率高，生产成本较低，适合大规模工业生产。

主权项

一种rhTRAIL菌体的分离纯化方法，其特征在于，包含粗纯工艺和精纯工艺：所述粗纯工艺为：将由重组DNA技术所得的rhTRAIL工程菌经扩大培养发酵所收集的菌体进行高压匀浆破碎、高速离心分离、微滤处理；所述精纯工艺为：将上一步所述粗纯工艺所得的粗纯样进行离子层析、疏水层析、凝胶过滤层析、浓缩得样品；在所述粗纯工艺中，所述高压匀浆破碎为：称取一定量冷冻保藏的rhTRAIL菌体加入适量的B1液后用组织捣碎机捣碎均匀至没有块状菌体，再一次加入适量的B1液使最终菌体浓度为10％，将捣碎均匀的菌体混悬液进行1500bar的压力破碎一次，收集匀浆破碎液并置于4‑8℃冷藏备用；所述高速离心分离为：将上述高压匀浆破碎所得的匀浆破碎液进行13000r/min离心30min，收集上清液并置于4‑8℃冷藏备用；所述微滤为：将上述高速离心分离所得的上清液进行微滤处理，收集透膜微滤液并置于4‑8℃冷藏备用，所收集的微滤液即为粗纯样；在所述精纯工艺中，所述离子层析为：UNOQ阴离子层析，先用0.5M/L NaOH以15mL/min处理UNOQ阴离子层析柱120min，再用B液以40mL/min处理柱子2个柱体积，然后用D液以40mL/min再生柱子1个柱体积，接着再用B液以40mL/min平衡柱子2个柱体积；柱子平衡完后，将上述微滤所得的粗纯样以40mL/min上样UNOQ阴离子层析柱，再用B液以40mL/min淋洗柱子2.5个柱体积，最后用C液以40mL/min进行洗脱，收集电导为8mS/cm的洗脱峰样；所述疏水层析为：Phenyl疏水层析，即先用0.5M/L NaOH以15mL/min处理Phenyl疏水层析柱120min，再用F液以40mL/min平衡疏水柱2个柱体积；柱子平衡完后，将上述离子层析收集的洗脱峰样液加入比例体积的G液使样液最后所含NaCl浓度与F液中NaCl浓度一致后以40mL/min上样疏水柱；用F液以40mL/min淋洗柱子2个柱体积，最后用E液以40mL/min一步洗脱，收集电导为150ms/cm的洗脱峰样；所述凝胶过滤层析为：Sepacryl S200层析，即先用0.5M/L NaOH以15mL/min处理S200层析柱120min，再用H液以40mL/min平衡柱子3个柱体积；柱子平衡完后，将上述疏水层析收集的洗脱峰样以40mL/min上样，最后用H液一步洗脱收集洗脱峰样；所述浓缩为：将上述凝胶过滤层析中收集的洗脱峰样进行超滤浓缩，浓缩10倍，收集浓缩样置于4‑8℃冷藏备用；所述B1液为50mM/L Tris‑HCl，pH8.5的缓冲液，使用前按菌体量加入0.1％DTT；所述B液为20mM/L Tris‑HCl，pH8.5的缓冲液；所述C液为20mM/L Tris‑HCl，80M NaCl，pH8.5的缓冲液；所述D液为20mM/L Tris‑HCl，2M NaCl，pH8.5的缓冲液；所述E液为20mM/LTris‑HCl，1.5M NaCl，pH8.5的缓冲液；所述F液为20mM/L Tris‑HCl，3M NaCl，pH8.5的缓冲液；所述G液为20mM/L Tris‑HCl，4M NaCl，pH8.5的缓冲液；所述H液为10mM/L Na₂HPO₄、10mM/L NaH₂PO₄、50mM/L NaCl、pH7.0的缓冲液。