产4-羟基扁桃酸的工程菌及构建方法

摘要

本发明公开了一种产4-羟基扁桃酸的工程菌及构建方法，构建方法为：人工合成4-羟基扁桃酸合成酶基因hmaS；合成trc启动子；与hmaS融合，得到片段trc-hmas；合成表达载体骨架SyBE-002866，将片段trc-hmas与SyBE-002866酶切连接得到重组载体SyBE-002868；敲除原始底盘大肠杆菌aspC基因，得到优化的底盘菌株BKT7；将SyBE-002868转化BKT7，对单克隆筛选，得到阳性转化子SyBE-002872；本发明使用工程大肠杆菌，以葡萄糖或葡萄糖和木糖为碳源，不需添加任何前体，进行发酵生产4-羟基扁桃酸。本发明可解决4-羟基扁桃酸的来源问题，降低成本。

主权项

产4‑羟基扁桃酸的工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)人工合成4‑羟基扁桃酸合成酶基因hmaS，所述4‑羟基扁桃酸合成酶基因hmaS如SEQ ID No.27所示；(2)全化学合成trc启动子或gap启动子，所述trc启动子如SEQ ID No.28所示；所述gap启动子如SEQ ID No.29所示；(3)将所述trc启动子与4‑羟基扁桃酸合成酶基因hmaS通过重叠延伸PCR融合，得到片段trc‑hmas；或将所述gap启动子与4‑羟基扁桃酸合成酶基因hmaS通过重叠延伸PCR融合，得到片段gap‑hmas；(4)全化学合成以SEQ ID No.30所示的表达载体骨架SyBE‑002866，或全化学合成以SEQ ID No.31所示的表达载体骨架SyBE‑002867；(5)将片段trc‑hmas与表达载体骨架SyBE‑002866通过酶切连接方式，得到重组载体SyBE‑002868；或将片段gap‑hmas与表达载体骨架SyBE‑002867通过酶切连接方式，得到重组载体SyBE‑002869；或将片段trc‑hmas与表达载体骨架SyBE‑002867通过酶切连接方式，得到重组载体SyBE‑002870；将片段gap‑hmas与表达载体骨架SyBE‑002866通过酶切连接方式，得到重组载体SyBE‑002871；(6)利用λ‑red同源重组技术，敲除原始底盘大肠杆菌aspC基因，得到优化的底盘菌株BKT7；(7)将重组载体SyBE‑002868转化底盘菌株BKT7，对单克隆筛选，得到阳性转化子SyBE‑002872；或将重组载体SyBE‑002869转化底盘菌株BKT7，对单克隆筛选，得到阳性转化子SyBE‑002873；或将重组载体SyBE‑002870转化底盘菌株BKT7，对单克隆筛选，得到阳性转化子SyBE‑002874；或将重组载体SyBE‑002871转化底盘菌株BKT7，对单克隆筛选，得到阳性转化子SyBE‑002875。