| 主权项 |
1.一种检测病人血清中榖氨酸脱羧(GAD)的自身抗体的方法,此方法包括把病人血清与GAD抗原接触,并检测在样本是否有GAD抗原与抗GAD自身抗体结合的情况,其特征为该GAD抗原制剂包括一个含有一提高数量的65kD和/或67kD的GAD的同等形式的二聚物或寡聚物。2.一种诊断糖尿病或糖尿病前期情况的方法,其包括:(i)从病人取得血清样本;和(ii)检测该样本中是否有抗GAD的自身抗体存在,作为诊断糖尿病或糖尿病前期情况的指标;其中:(iii)该样本中的抗GAD的自身抗体的检测是把血清与GAD抗原接触,并检测在样本是否有GAD抗原与抗GAD自身抗体结合的情况,其特征为该GAD抗原制剂包括一个含有一提高数量的65kD和/或67kD的GAD的同等形式的二聚物或寡聚物。3.如申请专利范围第1项或第2项的方法,其中该方法是在保持GAD的二聚体或寡聚体形式的条件下进行的。4.如申请专利范围第3项的方法,其中的该方法是在非致变性失活(non-denaturing)的条件下进行的。5.如申请专利范围第4项的方法,其中的该方法是在非还原性条件下进行的。6.如申请专利范围第1项或第2项的方法,其中的GAD抗原是选自人类或非人类哺乳类动物的,天然的或重组的,和胰脏或脑部或其他CNS,的GAD。7.如申请专利范围第1项或第2项的方法,其中的GAD抗原是包含基本上为纯化的GAD,其含有大于50%重量的二聚体或寡聚体形式的GAD。8.如申请专利范围第1项或第2项的方法,其中的GAD抗原是包含一个或其他的65kD和67kD的GAD同等形式的二聚体或寡聚体,和/或这两种同等形式的异二聚体或异寡聚体。9.一种用于检测血液样本中的抗GAD的自身抗体的诊断套件,包含GAD抗原和检测GAD与自身抗体结合的方法,其特征是该GAD抗原包含一种GAD制剂,其中包含有提高数量65KD及(或)67KD同等形式的GAD的二聚体或寡聚体。10.如申请专利范围第9项的诊断套件,其中该GAD抗原是选自人类或非人类哺乳类动物的,天然的或重组的,和胰脏或脑部或其他CNS,的GAD。11.如申请专利范围第9项的诊断套件,其中该GAD抗原是包含基本上为纯化的GAD,其含有大于50%重量的二聚体或寡聚体形式的GAD。12.如申请专利范围第9项的诊断套件,其中该GAD抗原是包含一个或其他的65kD和67kD的GAD同等形式的二聚体或寡聚体,和/或这两种同等形式的异二聚体或异寡聚体。图示简单说明:图1:显示125I-GAD的放射自显影法试验的结果。其中125I-GAD是在分别与三种代表性的IDDM血清进行沈淀反应,并利用SDS-PAGE方法在还原及非还原的条件下进行分析(见本文所述)。电泳道1和5含有非免疫沈淀125I-GAD,而电泳道2,3,4,6,7,8含有被从IDDM患者取得的三种代表性沈淀的125I-GAD。显而易见的是,在还原条件之下在大约64kD处有一个强的讯号,和在110-130kD处有弱的讯号,而在非还条件之下则在64kD处有一个弱的讯号,和在110-130kD处有强的讯号。图2:显示68个IDDM血清的终点滴定的结果,包括Stiff Man症候群(SMS)。所得的结果是与相同血清1:2稀释度所得的参考値配合作图。値得注意的是,平均値在加入5-10%总量的GAD时达到固定不变。这显示即使有极高效价的血清,亦并非所有制剂中的GAD皆能被沈淀出来。图3:显示125I-GAD的放射自显影法试验的结果,其中125I-GAD是在分别与三种患者血清进行沈淀反应,并利用SDS-PAGE方法在还原及非还原的条件下进行分析。于此,尤其是与图1比较,沈淀只有分子量大约为64kD的125I-GAD成份有移动。电泳道4和8是典型的IDDM血清。如一般预期,典型的IDDM血清(电泳道8)只与110-130kD的成份在非还原性条件有反应性的。在此放射自显法(如箭头所示)的软片曝光时有一弱的讯号。图4:显示GAD于SDS-PAGE分析后进行的Western点迹法分析的结果。该分析所用的GAD抗体是利用GAD于实验动物(A)和人类(B)取得,其血清稀释度为1:200。(A)单源小鼠抗体GAD-6是针对GAD 65的,而多源兔子抗体K2是针对GAD 67的;(B)电泳道1,显示对健康的人类样本所作试验的结果;电泳道2,是对SMS和IDDM患者样本所作试验的结果;电泳道3-10,是对IDDM患者样本所作试验的结果。图5:显示圆点点迹法(dot blotting)的试验结果。其中GAD是被点在硝基纤维素滤纸上,然后将滤纸与待测血清接触。上面一行(点2-10)显示IDDM血清与GAD在非致变性条件下进行的反应结果(见本文说明)。在下面一行(点2-10)显示IDDM血清与经ME和煮沸处理GAD在非致变性条件下进行的反应结果。其中只有血清2,和血清3(弱)有显现出反应性。点1代表正常血清。本图所示的血清是与图4中所示的血清相同。图6:显示重组GAD经生物合成标记(35S-GAD)后所作的放射自显影法的分析结果。这样可以保持利用兔网织红血球溶解物(RRL)进行基因表达所生成的天然GAD的正常构造。沈淀反应是利用阳性IDDM血清和阴性血清进行的。然后利用SDS-PAGE方法在还原性和非还原性的条件下进行分析。在各试验中,电泳道1含有RRL重组GAD(经接触19小时)。电泳道2含有RRL表达的GAD,其与IDDM血清有沈淀反应(经7天的接触)。电泳道3含有RRL表达的GAD,其是与正常的血清进行沈淀试验(经7天的接触)的。値得注意的是,沈淀下来的RRL表达的GAD经过在非还原性条件下进行分析,所得的主要讯号是在110-130 kD的位置出现的,显示GAD为二聚体形式。 |
