基于差动STED测量光滑自由曲面样品的方法

摘要

基于差动STED测量光滑自由曲面样品的装置和方法属于光学显微测量领域。本发明在光滑自由曲面样品表面镀上一层荧光膜，利用荧光膜在激光照射下向各个方向辐射荧光的特性，避免光束在光滑自由曲面发生镜面反射导致信号光难以收集的问题；同时，采用STED显微术原理，将两束不同波长脉冲激光光束会聚成的光斑重合，位于光斑中心区域的样品上的荧光膜激发出荧光，位于光斑内但不在光斑中心区域中的荧光膜发生退激发，不发出荧光，从而实现对样品的超分辨成像；采用差动探测结构，将收集到的两路信号进行差分运算得到差动响应曲线，通过差动响应曲线零点来确定样品表面位置，最终解决高精度测量具有较大斜率的光滑自由曲面样品形貌的问题。

主权项

基于差动STED测量光滑自由曲面样品的方法，所应用的基于差动STED测量光滑自由曲面样品的装置包括：激发模块、损耗模块、差动成像模块和镀膜样品(15)；所述的激发模块包括：波长为λ₁的第一皮秒脉冲激光器(1)、第一传导光纤(2)、第一准直物镜(3)、第一平面反射镜(4)；在波长为λ₁的第一皮秒脉冲激光器(1)之后依次配置第一传导光纤(2)、第一准直物镜(3)和第一平面反射镜(4)；所述的损耗模块包括：波长为λ₂的第二皮秒脉冲激光器(5)、第二传导光纤(6)、第二准直物镜(7)、第二平面反射镜(8)、涡旋状相位调制板(9)和二分之一波片(10)；在波长为λ₂的第二皮秒脉冲激光器(5)之后依次配置第二传导光纤(6)、第二准直物镜(7)和第二平面反射镜(8)，在第二平面反射镜(8)反射光路上依次配置涡旋状相位调制板(9)和二分之一波片(10)；所述的差动成像模块包括：第一二向色镜(11)、第二二向色镜(12)、四分之一波片(13)、聚焦物镜(14)、三维微位移载物台(16)、滤光片(17)、分光棱镜(18)、第一收集物镜(19)、第一针孔(20)、第一光电探测器(21)、第二收集物镜(22)、第二针孔(23)和第二光电探测器(24)；在第一二向色镜(11)的反射光路上依次配置第二二向色镜(12)、四分之一波片(13)、聚焦物镜(14)和三维微位移载物台(16)，在第一二向色镜(11)反向透射光路上配置滤光片(17)、分光棱镜(18)、第一收集物镜(19)、第一针孔(20)和第一光电探测器(21)，在分光棱镜(18)的透射光路上配置第二收集物镜(22)、第二针孔(23)和第二光电探测器(24)；所述的镀膜样品(15)为表面镀了荧光物质薄膜的待测样品；所述的激发模块中的波长为λ₁的第一皮秒脉冲激光器(1)发出激发光，经过第一传导光纤(2)和第一准直物镜(3)之后形成平行光，平行光束经过第一平面反射镜(4)、第一二向色镜(11)反射和第二二向色镜(12)、四分之一波片(13)、聚焦物镜(14)透射后在镀膜样品(15)上形成第一聚焦光斑；所述的损耗模块中的波长为λ₂的第二皮秒脉冲激光器(5)发出损耗光，经过第二传导光纤(6)和第二准直物镜(7)后形成平行光，经过第二平面反射镜(8)反射，涡旋状相位调制板(9)、二分之一波片(10)透射，第二二向色镜(12)反射和四分之一波片(13)、聚焦物镜(14)透射后，在镀膜样品(15)表面形成面包圈状的第二聚焦光斑；所述的镀膜样品(15)表面激发出的荧光经过聚焦物镜(14)、四分之一波片(13)、第二二向色镜(12)、第一二向色镜(11)、滤光片(17)透射后被分光棱镜(18)分为两束光，一束光被第一收集物镜(19)会聚，经过第一针孔(20)后被第一光电探测器(21)收集，另一束光被第二收集物镜(22)会聚，经过第二针孔(23)后被第二光电探测器(24)收集；所述的镀膜样品(15)表面通过蒸镀的方法镀上一层有机荧光膜，所述的荧光膜易溶于水或有机溶剂，厚度不超过1μm；所述的第一聚焦光斑和面包圈状的第二聚焦光斑中心重合；所述的第一针孔(20)位于第一收集物镜(19)焦面之后z₀处，第二针孔(23)位于第二收集物镜(22)焦面之前z₀处；其特征在于，包括以下步骤：(a)通过蒸镀的方法在样品表面形成一层厚度不超过1μm的有机荧光膜，所述的荧光膜与样品轮廓紧密贴合，形成镀膜样品(15)；(b)波长为λ₁的第一皮秒脉冲激光器(1)发出激发光，经过第一传导光纤(2)和第一准直物镜(3)之后形成平行光，平行光束经过第一平面反射镜(4)、第一二向色镜(11)反射和第二二向色镜(12)、四分之一波片(13)、聚焦物镜(14)透射后在镀膜样品(15)上形成第一聚焦光斑；(c)波长为λ₂的第二皮秒脉冲激光器(5)发出损耗光，经过第二传导光纤(6)和第二准直物镜(7)后形成平行光，经过第二平面反射镜(8)反射，涡旋状相位调制板(9)、二分之一波片(10)透射，第二二向色镜(12)反射和四分之一波片(13)、聚焦物镜(14)透射后，在镀膜样品(15)表面形成面包圈状的第二聚焦光斑，第一聚焦光斑和第二聚焦光斑中心重合；(d)荧光膜激发出的荧光经过第一光电探测器(21)和第二光电探测器(24)收集后，两路信号进行差分运算得到差动响应曲线，通过差动响应曲线零点来确定镀膜样品表面位置；对于所获得的两路差动信号能够进行两种计算处理：①对两路信号进行差动计算：I_D1(x_s,z_s)＝(|U_D(x_s,z_s,Δz)|²+c₀)‑(|U_D(x_s,z_s,‑Δz)|²+c₀)＝|U_D(x_s,z_s,Δz)|²‑|U_D(x_s,z_s,‑Δz)|²其中I_D1表示差动计算时系统的强度响应函数，U_D表示双通照明下系统的振幅响应函数,x_s和z_s表示位置坐标，Δz表示探测器离焦量，c₀表示信号中的共模噪声；②对两路信号进行抗串扰计算：$\begin{array}{c}{I}_{D2}(x_s,z_s)=\frac{({\left|U_D(x_s,z_s,\Delta z)\right|}^2+c_0)-({\left|U_D(x_s,z_s,-\Delta z)\right|}^2+c_0)}{({\left|U_D(x_s,z_s,\Delta z)\right|}^2+c_0)+({\left|U_D(x_s,z_s,-\Delta z)\right|}^2+c_0)}\\ =\frac{{\left|U_D(x_s,z_s,\Delta z)\right|}^2-{\left|U_D(x_s,z_s,-\Delta z)\right|}^2}{{\left|U_D(x_s,z_s,\Delta z)\right|}^2+{\left|U_D(x_s,z_s,-\Delta z)\right|}^2+2c_0}\end{array}$其中I_D2表示抗串扰计算时系统的强度响应函数；(e)三维微位移载物台(16)带动镀膜样品(15)三维移动，形成三维扫描成像；(f)使用水或有机溶剂清洗掉样品表面的荧光膜。