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1、一种用于基因工程的用柞蚕蛹生产外源基因产物的方法，它是将纯化的病毒粒子经抽提得到的APNPV DNA进行限制性内切酶酶谱分析、琼脂糖凝胶电泳、Southern转印，并用OpNPV核多角体蛋白基因为探针进行分子杂交确定多角体蛋白基因在ApNPV基因组中的位置，其特征在于：a.用大肠杆菌载体质粒(PAT153、Puc19)克隆、增殖所载该基因的DNA片段为5′端的PvuⅡ--BamHI片段和3′端的BamHI--PstI片段，分别以单链DNA和双链DNA为模板采用双脱氧序列分析法对所克隆的DNA片段进行核苷酸序列分析，读出柞蚕NPV核多角体蛋白的基因的全编码序列735bp和其两侧翼区部分非编码序列，采用Primer Extension方法确定该基因mRNA转录起始点位于nt--50的A位点，进而确定该基因的5′末端基因表达调控序列的位置；b、采用人工合成寡核苷酸引物引导点突变及PCR等技术将ApNPV多角体蛋白基因的起始密码子去掉(ATG突变为ATT)同时分别切掉nt+2～+140、nt+9～+140和nt+37～+140 5′末端编码序列，组建了PAPM740、741、748和736等系列基因转移载体；c、将外源基因分别克隆到所组建的四个载体中，抽提重组质粒DNA，并与抽提的ApNPV DNA一起转染柞蚕卵巢细脆或柞蚕蛹，待柞蚕细胞或柞蚕蛹感染发病后取其病毒液分别用空斑法或末端稀释法分离外源基因重组病毒；d将分离的重组病毒感染柞蚕蛹，经分离、纯化即可得到外源基因产物。 |
