克隆有人肿瘤坏死因子α(TNF)基因的变铅青链霉菌的构建方法

摘要

本发明涉及克隆有人肿瘤坏死因子-α基因的变铅青链霉菌的构建方法。本发明方法采用基因工程技术，以质粒P^IJ486为载体，其中包括通过T4-DNA连接酶将分别用EcoRI-HindIII双酶切得到的质粒PHTITNFcDNA片段和质粒PIJ486片段进行连接，通过转化使其克隆至变铅青链霉菌TK54，挑选转化子，提取重组质粒，得到No7转化子，获得了克隆有人肿瘤坏死因子-α基因的变铅青链霉菌TK54-HT(含有重组质粒P^IJT7)，将该克隆菌株进行发醇培养，即可获得肿瘤坏死因子蛋白，其表达水平可达1×10⁷单位/升以上，菌种遗传性稳定。

主权项

1、克隆有人肿瘤坏死因子-α(TNF)基因的变铅青链霉菌的构建方法，其中包括酶切、连接、转化、挑选转化子提取重组质粒和经确证后得到所需菌种五个步骤，其特征在于： a、连接：以质粒P^IJ486为载体，将经过限制性内切酶EcoRI-HindⅢ双酶切得到的质粒P^HT1TNFcDNA片段和经过限制性内酶EcoRI-HindⅢ双酶切得到的质粒P^IJ486片段相连接，cDNA片段浓度和载体DNA浓度比为3～5∶1，加入T4DNA连接酶，于10～14℃放置3小时以上进行连接，获得重组DNA分子； b、转化：采用上述a步骤中连接后的重组DNA，以变铅青链霉菌TK54的原生质体为受体，按照Hopwood等人的方法，将连接后的DNA转化至所说的受体菌中； c、挑选转化子及提取重组质粒：以含新霉素30μg/ml的R2琼脂平板挑选含重组质粒的转化子，凡是挑选出来的耐药菌落多为含重组质粒的转化子，采用Katz的快速碱变性方法提取含重组质粒的转化子，将琼脂糖凝胶电泳后确定为重组质粒的样品再用EcoRI-HindⅢ酶切后的DNA片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌体DNA限制性内切酶HindⅢ酶切片段的距离进行比较从而确定各片段分子量大小，其中№7转化子所含重组质粒P^IJT7插入片段为615bp与TNFcDNA相同，经L929细胞毒实验、中和实验和SDS-聚丙酰胺凝胶电泳确证：№7转化子为人肿瘤坏死因子-α的基因工程菌。