| 主权项 |
1﹒一种包括TnlO tetA基因一部份之DNA序 列,其系含有一个四环素抑制物结合位置 、核糖体结合位置的5'区域及转译起始 密码子,其改良部份包括:利用含有一个 限制碗切割位置之替代核有酸序列至少部 份取代该四环素抑制物结合位置,让替代 序列含有pCDSal序列 区部份,亦包括一蛋白质之编码区。 2﹒根据申请专利范围第1项的序列,其中该 蛋白质是由基因移转子Tn10之teth基因, 或是金黄葡萄球菌的tetK基因所编码之四 环素溢流唧筒。 3﹒根据申请专利范围第2项的序列,其包括 一个SalI限制茧切割位置,一个ATG起 始密码子,以及tetA编码区域或tetK编码 区城。 4﹒一种制备可低度表现蛋白质之质体的方法 ,其包括将根据申请专利范围第1至3项 中任一项的序列连接至适当质体中。 5﹒一种制备可低度表现蛋白质之宿主细胞的 方法,其包括以根据申请专利范围第1至 3项中任一项的序列转形大肠杆菌宿主细 胞。 6﹒根据申请专利范围第5项的方法,其中该 序列是包含于一个质体上。 7﹒一种制备可表现金黄葡萄球菌tetK基因之 大肠杆菌宿主细胞之方法,其包括以包括 tetK编码区之根据申请专利范围第1项之 序列转形大肠杆菌宿主细胞。图示简单说明: 图1A,亲系质体(parental plasmid pcB258与四种衍生质体pCBSal、pGG57. pGG71与pGG75的图形说明。质体pCBSal 与pCB258上含有来自大肠杆菌基因移转子 Tnl0,为四环素溢流唧筒编码的tetA基因 。图中说明出现在质体pCBSal及pCB258的 tetA之转录作用起始点两旁发现的限制| 切割位置。质体pCBSal是将位在pCB258上 的一部份四环素抑制物操纵基因位置删除 掉,并另含有两个限制| 切割位置(SalI 及Xho)。质体pGG57及pGG71含有为 来自金黄葡萄球菌的四环素溢流唧筒编码 之tetK基因、此基因是出现在分别称为 GG1及GG2的M13噬菌体所分离出来的, GG2两者均由M13噬菌体MC71经过寡核| 酸所调节之定点式突变作用产生。质体 pGG5含有一个为来自pBR322之四环素溢 流唧筒编码的tetC基因,利用聚合链链结反 应(polymerase chain reaction)将Sall限 制|切割位置加至tetC基因5'端的ATG 上。利用DNA序列分析发现,调节tetC表 现至高度四环素抗药性时所涉及一个无特 微的调节突变是位在tetC编码区域外。 而lacl基因为lac抑制物编码,此抑制物 可利用IPTG在tac启动子控制下调节基因 表现。 B.最上面的核酸序列是来自介于 tetR为四环素抑制物编码)与tetA为 四环素溢流唧筒编码)之间的基因移转子 Tn10。序列下画线处为Tn10上所发现的两 个操纵基因位置(operator site),从限 制|切割分析推断,在此两个操纵基因位 置间存在BamHI限制|切割位置。虽然 pCBSal含有两个独特的限制|切割位置, 但是此种变化并不会导致tetA所编码蛋白 质之胺基酸序列改变。这两个tetK构筑体 之间唯一的差异是转译作用的起始点。质 体pGG75含有ATG起始密码子(画线处) ,而pGG71含有TTG起始密码子(画线处 )。每个构筑体的起始密码子均以箭头标 示出来。 图2靠近tetK基因的起始密码子处 进行定点式突变作用(site-directed mutagenesiS)。图中出示利用寡核|酸所 调节之定点式突变作用在噬菌体MC71靠近 tetK起始密码子改变的DNA区域。寡核| 酸所调节之定点式突变作用:(1)欲使之 突变的单股DNA模板(temp1ate),(2)一 小段互补寡核|酸(20-40 b.p),其中 应含有希望引进DNA片段中之所需变化。 使该寡核|酸能够炼合(anneal)至互补的 单股模板化。一旦炼合完成,则寡核|酸 的3'-0H基团便可做为所加入的DNA聚 合|之引子(primer),如此便能产生双股 DNA产物。此双股DNA产物中的一股便含 有因寡核|酸引子引进的突变。 用两种不同的寡核|酸引子(PTl813 及PTl814)进行此项技术。图中说明天然 tetK基因的起始位置上或附近位置的DNA 序列变化。这两种寡核|酸所调节之定点 突变反应在tetK基因的5'端位置产生了 一个Sall切割位置,为此等构筑体进入 pCBSal提供一条方便的途径。除了sall切 割位置外, pGG57尚含有起始位置为ATG 的tetK基因,而pGG71则含有起始位置为 TTG的tetK基因。除了这些改变外,这两 个tetK构筑体之DNA阶段上均相同。 图3A质体pCBSal,pGG57,pGG75及 pGG71在大肠杆菌菌株MCl061中的四环素 抗药性图形。细胞系于路里亚营养汁 (Luria Broth)液体培养基(8)中生长, 以0.85%食盐水系列稀释后,涂抹于琼脂 培养皿上,琼脂培养皿于IPTG浓度渐增下 ,含有逐渐提高之四环素浓度(意指一个 浓度的四环素做数个渐增的IPTG浓度,而 且做了数个四环素浓度)。培养皿置于37 ℃下培养16小时。图上出示至少杀死90% 菌落形成成单位(colony forming units) 时所需之四环素最低抑制浓度(LD90)。 图3B含pGG57或pGG76之大肠杆菌菌 株MCI1061的四环素抗药性图形,这两个质 体均含有tetK基因及相同的调节性区域, 但是它们的质体复制区(replication rigion)不相同。取得此等图形之实验步 骤和图3A中所做的实验步骤相同。 图4A所列质体是pGG57的衍生质体。 质体pGG76为内含lacl及tetK基因之 pGG57之pACYCl84衍生质体。质体pGG77 及pGG84则缺失部份位于tetK编码区域内 的DNA序列。 图4B大肠杆菌TK2205置于内含12.5mM 钾离子之基本培养基(minimal media)9 小时的生长曲线图。材料是大肠杆菌 TK2205及含有质体pGG76,pGG77或 pGG84的大肠杆菌TK2205。每个培养物中 含有能使钾离子吸收缺失恢复至最大效能 的IPTG含量。 GG2两者均由Ml3噬菌体MC71经过寡核| 酸所调节之定点式突变作用产生。质体 pGG75含有一个为来自pBR322之四环素溢 流唧筒编码的tetC基因,利用聚合|链结反 应(p01ymerase chain reacti0n)将sa11限 制|切割位置加至tetC基因5'端的ATG 上。利用DNA序列分析发现,调节tetC表 现至高度四环素抗药性时所涉及一个无特 微的调节突变是位在tetC编码区域之外。 而lacI基因为lac抑制物编码,此抑制物 可利用IPTG在tac启动子控制下调节基因 表现。 B,最上面的核酸序列是来自介于 tetR(为四环素抑制物编码)与tetA以(为 四环紊溢流唧筒编码)之间的基因移转子 Tnl0。序列下画线处为Tnl0上所发现的两 个操纵基因位置(0perat0r site),从限 制馥切割分析推断,在此两个操纵基因位 置间存在BamHl限制脢切割位置。虽然 pCBSal含有两个独特的限制脢切割位置, 但是此种变化并不会导致tetA所编码蛋白 质之胺基酸序列改变。这两个tetK构筑体 之间唯一的差异是转译作用的起始点。质 体pGG75含有ATG起始密码子(画线处) ,而pGG71含有TTG起始密码子(画线处 )。每个构筑体的起始密码子均以箭头标 示出来。 图2靠近tetA基因的起始密码子处 进行定点式突变作用(site一directed mutagenesiS)。图中出示利用寡核若酸所 调节之定点式突变作用在噬菌体MC71靠近 tetK起始密码子改变的DNA区域。寡核| 酸所调节之定点式突变作用:(1)欲使之 突变的单股DNA模板(telnplate),(2)一 小段互补寡核|酸(20一40b.p),其中 应含有希望引进DNA片段中之所需变化。 使该寡核若酸能够炼合(anneal)至互补的 单股模板化。一旦炼合完成,则寡核若酸 的3'一OBm基团便可做为所加入的DNA聚 合|之引子(primer),如此便能产生双股 DNA产物 此双股DNA产物中的一股便含 n凡Ix八 。有因寡核|酸引子引进的突变。 用两种不同的寡核|酸引子(PTl83 及PT1814)进行此项技术。图中说明天然 tetK基因的起始位置上或附近位置的DNA 序列变化。这两种寡核|酸所调节之定点 突变反应在tetk基因的5'端位置产生了 一个Sall切割位置,为此等构筑体进入 pCBSal提供一条方便的途径。除了sa1I切 割位置外, pGG57尚含有起始位置为ATG 的tetK基因,而pGG71则含有起始位置为 TTG的tetK基因。除了这些改变外,这两 个tetK构筑体之DNA阶段上均相同。 图3A质体pCBSal,pGG57,pGG75及 pGG71在大肠杆菌菌株Cl061中的四环素 抗药性图形。细胞系于路里亚营养汁 (Luria Br0th)液体培养基(8)中生长, 以0.85%食盐水系列稀释后,涂抹于琼脂 培养皿上,琼脂培养皿于IPTG浓度渐增下 ,含有逐渐提高之四环素浓度(意指一个 浓度的四环素做数个渐增的IPTG浓度,而 11做了数个四环素浓度)。培养皿置于37 ℃下培养16小时。图上出示至少杀死90% 菌落形成成单位(Colony f0rming units) 时所需之四环素最低抑制浓度(LD90)。 图3B含pGG57或pGG76之大肠杆菌菌 株Mcl061的四环素抗药性图形,这两个质 体均含有tetK基因及相同的调节性区域, 但是它们的质体复制区(replication rigion)不相同。取得此等图形之实验步 骤和图3A中所做的实验步骤相同。 图4A所列质体是pGG57的衍生质体- 质体pGG76为内含lacI及tetK基因之 pGG57之PACYCl84衍生质体。质体pGG77 及pGG84则缺失部份位于tetK编码区域内 的DNA序列。 图4B大肠杆菌TK2205置于内含12.51mM 钾离子之基本培养基(minima1 media)9 小时的生长曲线图。材料是大肠杆菌 TK2205及含有质体pGG76,pGG77或 pGG84的大肠杆菌TK2205 每个培养物中 含有能使钾离子吸收缺失恢复至最大效能 的IPTG含量。 |
