一种固定化蛋白酶试剂的制备及其应用

摘要

本发明公开了一种固定化蛋白酶试剂的制备及其应用。本发明公开的一种固定化酶由疏水性载体材料和固定在所述疏水性载体材料上的蛋白酶组成。本发明公开的利用表面引发原子转移自由基聚合法（SI‑ATRP）分别制备的亲水、疏水两种不同性质的聚合物链修饰的磁性纳米颗粒固定化胰蛋白酶，实现了蛋白的快速、高效、全面酶解，并且将两种亲、疏水性质不同的固定化蛋白酶联合使用，实现了互补性酶解，可有效降低载体选择性造成的酶解偏性，提高蛋白质酶解的全面性，从而显著增加蛋白质和肽段的鉴定数量。

主权项

一种固定化酶混合物，由疏水性载体材料为基底的固定化酶和以亲水性载体材料为基底的固定化酶组成；所述疏水性载体材料为基底的固定化酶与所述以亲水性载体材料为基底的固定化酶的质量比为1∶1；所述疏水性载体材料为基底的固定化酶由疏水性载体材料和固定在所述疏水性载体材料上的蛋白酶组成；所述疏水性载体材料为疏水性单体在带有表面引发原子转移自由基聚合引发剂的颗粒的表面发生原子转移自由基聚合而得到的产物；其中，所述疏水性单体聚合成聚合链；所述疏水性单体聚合而成的聚合链与所述颗粒通过C‑Si‑C键连接；所述疏水性载体材料上的蛋白酶与所述疏水性载体材料上的聚合链通过碳氮键链接；所述带有表面引发原子转移自由基聚合引发剂的颗粒为将表面引发原子转移自由基聚合引发剂固定连接在所述颗粒的表面制成；所述表面引发原子转移自由基聚合引发剂的一端为能与硅羟基结合的偶联剂，另一端为原子转移自由基聚合引发剂；所述疏水性单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯；所述固定连接的方法为所述表面引发原子转移自由基聚合引发剂与所述颗粒表面的硅羟基发生脱水反应生成硅氧键共价连接；所述以亲水性载体材料为基底的固定化酶由亲水性载体材料和固定在所述亲水性载体材料上的蛋白酶组成；所述亲水性载体材料上的蛋白酶与所述亲水性载体材料通过碳氮键链接；所述亲水性载体材料为亲水性单体在所述带有表面引发原子转移自由基聚合引发剂的颗粒的表面发生原子转移自由基聚合而得到的产物；其中，所述亲水性单体聚合成聚合链；所述亲水性单体聚合而成的聚合链与所述颗粒通过C‑Si‑O键连接；所述颗粒的表面引发原子转移自由基聚合引发剂的一端为能与硅羟基结合的偶联剂，另一端为原子转移自由基聚合引发剂；所述偶联剂为硅烷偶联剂；所述硅烷偶联剂为3‑氨基丙基三乙氧基硅烷、3‑氨基丙基三甲氧基硅烷或γ‑巯丙基三乙氧基硅烷；所述原子转移自由基聚合的引发剂为2‑溴异丁酰溴、α‑溴代异戊酰溴或α‑溴丙酰溴；所述硅烷偶联剂与所述原子转移自由基聚合的引发剂由酰胺键连接；所述亲水性单体为含有单糖基团的亲水性单体、丙烯酸类单体、丁烯酸类单体或戊烯酸类单体；所述单糖为氨基葡萄糖或氨基甘露糖；所述颗粒为磁性纳米颗粒；所述磁性纳米颗粒为二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒；所述疏水性和亲水性载体材料上的蛋白酶均为胰蛋白酶、蛋白内切酶、胞内蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。