新颖大肠杆菌–棍棒状菌穿梭载体之构筑法

摘要

本发明是关于构筑二个可以穿梭在大肠杆菌与棍棒状菌之间穿梭载体的方法。这二个穿梭载体，pUCL10及pUCL11具有棍棒状菌内生载体的复制起始点及在大肠杆菌中可复制的复制起始点，六个可选植基因的限制嵌入位置，可加强基因表现的lac启动子，lacZ基因为外来基因嵌入与否的筛选指标，以康钠霉素（kanamycin）的抗药基因。此二穿梭载体的应用范围不仅在胺基酸工业，另亦可应用医药品，饲料，化粧品，酵素……等工业上，同时在学术上(如植物病理、医学)上亦具有基础研究的价值。

主权项

1﹒一种构筑穿梭载体pUCL10及pUCL11之方法 ,其保将大肠杆菌质体pUC4─KlXX上之抗 抗霉钠素(kanamycin)基因以限制Hind Ⅲ及SmaⅠ切割后选植至以限制hindⅢ 及PvuⅡ切割后大肠杆菌载体pBR322上筛 得载体pDR26;再将棍棒状菌的内生载体 pNTⅠ以限制HindⅢ切割后嵌入pBK26 的HindⅢ位置,得到载体pBKN12;最后将 pBKN12以限制PstⅠ及HpaⅠ切割出可 在棍棒状菌中复制存留的片段,pDK26以 限制PstⅠ及NdeⅠ切割出含抗抗徽钠 素的基因及将 pUC18以限制WNdeⅠ及 DraⅠ切割出1ac传动子与1acZ基因,多 重限制嵌入位置(multiple cloning sites)及可在大肠杆菌中复制存留的片段 ,将此三个片段接合一起即得穿梭载体 pllCL10;或以pUC19代替pUC18用限制 Nde1及DraⅠ切割后之片段与p11K26及 pBKN1B所切割出的片段接合一起,而得到 穿梭载体pUCL11。 2﹒如申请专利范围第1项所述之方法,穿梭 载体pUCL10及pDCL11分别具有来自pUC18 或pUC19之能在大肠杆菌复制之复制起始 点及来自pNT1之能在棍棒状菌复制之复制 起始点,为适用于大肠杆菌,棍棒状菌及 其它能让此二载体复制存留之任何细菌。 3﹒如申请专利范围第1项所述之方法,穿梭 载纽pUCL10及pUCL11分别具有来pOC18或 pUClS之多重嵌入位置(multiple cloning site) ,包括EcoRⅠ,SaC1 Kpn1,Sma1﹒DamH1 ,Sa11,及其中任何 一项或多项之组合,供多样选择。 4﹒如申请专利范围第1项所述之方法,穿梭 载体pUCL10及pUCL11的分子量很小,约 5990盐基对(basepairs) ,利于转形作用。 5﹒如申请专利范围第1项所述之方法,穿梭 载体pucL10及pUCL11分别具有来自pUC18 或plrC19之1ac传动子以驱动外来基因的 表现。 6﹒如申请专利范围第1项所述之方法,穿梭 载体pUCL10及pUCL11分别具有来自pUC18 或pUC19之1acZ基因片段以做为载体是否 嵌入外来基因之指标。 7﹒如申请专利范围第1项所述之方法,穿梭 截体PUCL10及pOCL11具有抗抗霉钠素 (Kanmycia)基因供筛选是否含此二载体的 指标。图示简单说明: 图一、载体pBK26的构筑 图二、载体pBKN12的构筑 图三、载体pUCL10的构筑 图四、载体pUCL11的构筑 图五、色胺酸trpE选植到PUCLlO之流 程图 图六、棍棒状菌色胺酸生合成的酵素 基因群选植到PUCL10的流程图 图七、不同来源pBEA10的BamHI限制 霉图谱比较 图八、pDEAlO在ATCC13032—tyr— l中稳定性测试