全氧式菌包杂交组培活性液体接种技术

摘要

本发明所述的全氧式菌包杂交组培活性液体接种技术，属于食用菌生产技术领域，先将食药用菌进行液体发酵，液体发酵技术是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程；不用人工针刺通气供氧，不用人工扎孔排黄水，保温保湿性能好，出菇批次多，一次装料接种根据菇类不同可连续采收鲜菇3‑6个月；一年两次生产接种，利用太空包全氧通气培菌，菌丝生长快速旺盛，提高培菌速度50％以上。

主权项

一种全氧式菌包杂交组培活性液体接种技术，特征先将食药用菌进行液体发酵，液体发酵技术是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程；液体菌种是用液体培养基培养而成的菌种，目前我国已能进行深层发酵的食用菌有：香菇、平菇、凤尾菇、美味侧耳、鲍鱼菇、金针菇、黑木耳、猴头、草菇、蜜环菌、茯苓、滑菇和冬虫夏草等，具体步骤有：一、液体菌种的培养方法，有采用摇床来生产的摇瓶培养法和采用发酵罐来生产的深层培养法；若少量生产，可以用摇瓶培养法；深层培养需要一整套工业发酵设备，如锅炉、空气压缩机、空气净化系统、发酵罐等，故投资大，只适用于工厂化的大规模生产；而摇瓶培养投资少，设备技术简单，适合一般菌种厂生产使用；本节主要介绍摇瓶培养的技术方法；1、食用菌液体发酵的培养基根据培养基中组成的不同，可分为天然培养基和合成培养基；天然培养基的组成均为天然有机物；合成培养基则是采用一些已知化学成分的营养物质作培养基；在生产上，还根据工艺将培养基分为孢子培养基、种子培养基及发酵培养基；但无论如何划分，每一种培养基的组成中都离不开碳、氮、无机盐、微量元素、维生素和生长素等；①构成菌丝细胞的碳、氮比通常是：8‑12∶1；由于菌丝生长过程中，一般需50％的碳源作为能量供给菌丝呼吸，另50％的碳源组成菌体细胞；因此培养基中理想碳、氮比的理论值为16‑24∶1；太空包全氧通气，在液体培养中以菌丝增殖培养，通常碳、氮比以20∶1为宜；虽然食用真菌的液体培养一般要求较高的碳与氮比，即C∶N＝20∶1左右生长较好，但许多菌种也能在较宽的碳、氮比范围内生长；不同的菌种所要求合适的碳、氮比；②无机盐与微量元素，许多无机盐及微量元素对菌种的生理过程的影响与其浓度有关；不同的菌种，对无机盐及微量元素要求的最适浓度也不同；磷磷是细胞中核酸、核蛋白等重要物质的组成部分，又是许多辅酶高能磷酸键的组成部分；磷是食用菌液体发酵不可缺少的物质，常加入磷酸二氢钾以提供磷，加入量大约为0.1％‑0.15％；镁在细胞中起着稳定核蛋白、细胞膜和核酸的作用，而且是一些重要酶的活化剂，是食用真菌液体培养中不可缺少的营养成分；一般通过加入硫酸镁以提供镁，浓度通常是0.05％‑0.075％；钾、钙和钠，钾不参与细胞结构物质的构成，但控制原生质的胶态和细脑膜的透性；钙离子与细胞透性有关；钠离子能维持细胞渗透压，钠离子可以部分代替钾离子的作用；三种物质需求量甚微，若采用大然培养基，可不必另加；硫和铁，硫是菌体细胞蛋白质的组成部分，铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分，亦是菌体有氧代谢中不可缺少的元素；锌、锰、钴、铜锌、锰、钴等离子是某些酶的辅基或激活剂；铜是多元酚氧化酶的活性基；在配制培养基时应注意，镁和磷的添加不宜过多，否则会带来危害；菌体对锌、锰、钴、铜等微量元素的需求量甚少，一般天然有机原料中均有，不必另加；碳酸钙本身不溶于水，但可以调节培养其中的酸碱度；磷酸盐与碳酸钙不宜混合灭菌，否则会形成不溶于水的磷酸盐，使可溶性的磷酸盐浓度大大降低；③维生素，维生素在细胞中作为辅酶的成分，具有催化功能；大多数食用真菌的培养都与B族维生素有关，维生素B1是目前已知对绝大多数食用真菌生长有利的维生素；其适宜浓度在50‑1000μg/L之间；2、摇瓶振荡培养技术，培养液配制好后，装入500mL容量的三角烧瓶中，每瓶装量为100mL，并加入0～15粒小玻璃珠，加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.5kg/cm²压力下灭菌30分钟，取出冷却到30℃以下时，接入一块约2平方厘米的斜面菌种，于23℃～25℃下静置培养48小时，再置往复式摇床上振荡培养，振荡频率为80～100次/分，振幅6cm～10cm；如果用旋转式摇床，振荡频率为200～220转/分；摇床室温控制在24℃～25℃，培养时间因菌类不同而异，一般是在7天左右；培养结束的标准是：培养液清澈透明，液中悬浮着大量小菌丝球，并伴有各种菇类特有的香味；二、液体菌种的检验方法，对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法；1、感官检查可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查；看：将样品静置桌上观察；一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明；二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清；三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80％左右；四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达4.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变；五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线；旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点；醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用；菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡；再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌；嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味；培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味；2、取样测验可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测pH值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观察、普通染色和特殊染色等；三、液体菌种的使用方法，液体菌种可作原种使用，也可作栽培使用；1、作原种取一支100ml，兽用注射器，去掉针尖，换一根内径1mm～2mm，长100mm～120mm的不锈钢钢管，制成一个菌种接种器；使用前，洗净接种器并用纱布包好，经高压蒸汽灭菌，冷却后抽取液体菌种即可进行接种；经灭菌待接入菌种的原种瓶，先要在无菌条件下去掉棉塞，并改换无菌薄膜包扎瓶口；接种时，将针管插入瓶口上的薄膜，每瓶接种量为10mL～15ml，要注意使液体菌种均匀分布在培养基表面，拔出针管后要立即用胶布贴封针孔，竖放在培养室的床架上进行培养；2、作栽培种或直接进行栽培液体菌种在作栽培使用时，瓶栽的每瓶接种量为10mL～15mL；熟料袋栽的每袋接种量为，小袋10mL～15mL，大袋的20mL～30mL；开放式床栽的，每平方米接种量为500mL～1000mL，不需要接种针筒，可直接均匀洒在培养料面，或进行穴播。