单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法

摘要

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种鉴定单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法，该方法包括以下步骤：1）PNA分子信标的设计；2）液相PNA分子信标的原位杂交；3）荧光扫描；4）荧光扫描结果的判断。本发明PNA具有良好的细胞穿透性，与DNA和RNA特异性结合的高稳定性，使本发明的检测方法具有准确、灵敏的特点。同时将PNA探针结合分子信标标记和荧光扫描技术，在大幅降低假阳性、克服假阴性的情况下大幅提高检测效率，最后用显微镜对阳性样品进行确证，使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。

主权项

单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1）PNA分子信标的设计在具有单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）特异性的PNA探针的5’端和3’端分别标记报告荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1；PNA探针的序列为TAGTACAAAGGGTCG；2）液相PNA分子信标的原位杂交离心，2000g，5min，收集对数生长期的细菌，用磷酸缓冲液PBS洗涤一次，离心，2000g，5min，弃PBS，用50%酒精/PBS固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在OD₆₀₀=1.0‑1.5,室温固定1小时后置于‑20℃保存； 取100μl 固定好的菌体，离心，2000g，5min，弃上清, 加入50μl含300 pmole/ml PNA的杂交缓冲液室温重悬，杂交缓冲液pH9.0，20 mM Tris，100 mM NaCl，0.5%（w/v）十二烷基硫酸钠；同时设置两组阴性对照：对照一：用50μl不含PNA探针的杂交缓冲液重悬；对照二：用40 μg/ml RNase 重悬，RNase pH7.5 ，37℃温育1小时，离心，2000g，5min，弃上清后加入50μl含300 pmole/ml PNA的杂交缓冲液重悬；样品于薄壁PCR管中，55℃ 水浴1.0小时；离心2000g，5min，弃杂交缓冲液， 加入200μl已预热至55℃的洗涤缓冲液，洗涤缓冲液pH9.0，10 mM Tris，1 mM EDTA，55℃水浴20min, 2000g离心5min，弃洗涤缓冲液，再重复洗涤1次, 加110～150 μl洗涤缓冲液重悬；3）荧光扫描取上述三种的重悬液加入黑色孔板中，将荧光检测系统的吸收光谱和激发光谱调整到相应的波长，进行荧光扫描检测；4）荧光扫描结果的判断将对照二设置为空白，值为0，将扫描后数值大于0的结果判断为阳性；将对照一设置为空白，将扫描后数值大于0，且同时该孔在设置对照二为空白时扫描值又小于0，同时满足上述2个条件的杂交液也判断为阳性； 5）显微镜观察将步骤4）荧光扫描结果判断为阳性的对应步骤2）中的重悬菌液取2～5μl涂片，风干后荧光显微镜观察荧光亮度及细菌的形态，对结果加以确证；上述的方法不应用于疾病的诊断。