主权项 |
一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法,主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤,其特征在于,具体为:步骤一、样品处理:主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养;步骤二、菌落转印:取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N,Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃,然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上,并与菌落接触,直至NC膜完全浸湿,在3个或更多不对称位置上做好标记,用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下;26℃培养原平板,以便后期挑取产TTX阳性菌株;步骤三、抗原包被:将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37%甲醛溶液,封口膜密封平皿,置振荡器上,1hr,37℃。步骤四、封闭:将膜,用PBS‑T洗涤3次,每次3分钟,然后用牛血清封闭;步骤五、洗涤,加一抗:用PBS‑T洗涤3次,每次3分钟,将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育;步骤六、洗涤,加二抗:用PBS‑T洗涤3次,每次3分钟,将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育;步骤七、斑点显色:用PBS‑T洗涤3次,每次3分钟,用10ml,1mg/mL pNPP溶液10ml孵育,10min,直至斑点可见。若用于定量检测,可置酶联免疫分析仪系统根据斑点亮度计算TTX含量。 |