一种外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法

摘要

本发明提供一种γδT细胞的诱导扩增培养方法，涉及人外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法。本发明是通过应用细胞因子白介素‑2和帕米磷酸二钠联合培养外周血单个核细胞，诱导其少量γδT细胞的大量快速增殖，然后采用MACS阳性分选富集，富集后进行细胞纯度和活力检测以确保用于临床治疗。本发明方法培养和富集过程简单易行，周期较短，成本低廉；获得率高，重复性好；富集后细胞活力好，富集后细胞数量和活力均能保证临床肿瘤免疫治疗的应用，值得应用推广。

主权项

一种γδ T细胞的诱导扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：A.人单个核细胞的制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用PBS缓冲液重悬洗涤细胞两次；B.红细胞的去除：收集得到的单个核细胞红细胞裂解液重悬，裂解残存的红细胞；C. γδ T细胞的诱导扩增：将步骤B所制备的单个核细胞接种到含有20％胎牛血清的完全RPMI 1640培养液中，接种当日按第1天计算，在第1天加入帕米磷酸二钠，在第3天加入白介素‑2和帕米磷酸二钠，接着在第6、9、12、15、18天进行半量换液，每次换液时加入新鲜白介素‑2和帕米磷酸二钠；D. γδ T细胞数量含量的检测：以CD3和TCR γδ双阳性细胞作为γδ T细胞的表型特征；E. γδ T细胞状态的检测：在第1和18天时用倒置相差显微镜查看细胞生长状态；F. γδ T细胞的富集和获得数量：采用免疫磁珠阳性分选方法无菌分选TCR γδ阳性细胞群，该群细胞内富含γδ T细胞，收集所有细胞计数获得γδ T细胞的数量；G.富集后细胞纯度和细胞毒性的检测：富集后细胞用流式细胞术检测其纯度，并检测其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。