细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨及其制备方法

摘要

本发明公开的细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨，具有较高的机械强度，在干、湿状态下的弹性模量分别可达350MPa、100MPa，在植入体内初期能够提供较好的组织支撑，该组织工程骨与天然骨内部的矿物化结构和分布极为接近，具有高度类似于天然骨的微观结构，利于植入后更好地被识别和加速骨再生；本发明公开的仿生复合工程骨的制备方法，是一种新型的组合诱导成骨细胞分化及矿物化方法，通过钙离子和淫羊藿苷组合培养液刺激SIS上的成骨细胞，在SIS材料上进行大量的原位矿物化和成骨分化，同时可以避免钙离子对于分化后期重要基质蛋白OCN的抑制，增强工程骨的成骨诱导性，最终实现SIS材料上大量羟基磷灰石结晶和类骨细胞外基质沉积，且机械强度较SIS本身有大幅提高。

主权项

细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨，其特征在于该仿生复合工程骨的微观结构包括SIS胶原纤维骨架、矿物化结晶和细胞外基质成分，所述的SIS胶原纤维骨架呈网状纤维结构，所述的矿物化结晶和所述的细胞外基质成分沉积于所述的SIS胶原纤维骨架上，所述的矿物化结晶和所述的细胞外基质成分由MC3T3‑E1 Subclone 14细胞指导和分泌得到，所述的矿物化结晶主要由羟基磷灰石结晶构成，该细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨的制备方法包括以下步骤：1)细胞培养及传代：准备含有5‑10％胎牛血清的α‑MEM培养基作为培养液；将从小鼠颅顶前骨MC3T3‑E1细胞系中分离的MC3T3‑E1 Subclone 14细胞置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，所述的培养液的用量为200μL/cm²，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，确保培养液的用量为200μL/cm²，当培养至MC3T3‑E1Subclone 14细胞汇合度大于90％时进行细胞传代，所述的细胞传代的过程为：弃去旧的培养液，加入用量为200μL/cm²的PBS缓冲液，清洗2‑3次；然后加入用量为40‑50μL/cm²的0.25％的胰酶，在37℃下孵育1min；收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min；弃去上清，然后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将所述的细胞悬液以(1‑2)×10⁴细胞/cm²的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养；重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3‑E1Subclone 14细胞；2)SIS仿生工程骨的制备：取出干燥无菌的SIS材料，用剪刀或合适器械裁剪成所需的大小及形状，再将裁剪好的SIS材料浸泡于所述的培养液，置于37℃的细胞培养箱中预处理24‑48h；取汇合度为70‑80％的MC3T3‑E1Subclone 14细胞，加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min，弃去上清，再加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，然后根据计算得到的细胞密度将该细胞悬液稀释至1×10⁶细胞/mL的终浓度，即配制得到细胞悬液；取出浸泡24‑48h的SIS材料，平铺于新的细胞培养皿上，再按5×10³细胞/mm²的细胞密度将配制得到的稀释的细胞悬液均匀滴加于SIS材料上，完成对SIS材料的细胞种植，然后立即放入细胞培养箱中孵育；孵育4‑6h后，取出植有细胞的SIS材料，用1‑2mL/cm²用量的培养液清洗2‑3次，除去表面未黏附的细胞，之后以2.5mL/cm²的用量加入新的培养液，最后将该植有细胞的SIS材料置于细胞培养箱孵育；3)复合工程骨的制备：植有细胞的SIS材料于细胞培养箱孵育16h后，得到细胞‑SIS复合材料，从细胞培养箱中取出该细胞‑SIS复合材料，弃去旧的培养液，加入等量诱导矿物化及成骨分化的组合培养液，所述的组合培养液为含有8‑15mM的CaCl₂、(1‑10)×10^‑6M的淫羊藿苷和5‑10％胎牛血清的α‑MEM培养基，然后置于37℃的细胞培养箱孵育，此后每隔48h更换一次组合培养液，处理4‑8周时间后，得到SIS复合工程骨；4)复合工程骨的去细胞化：取出上述处理得到的SIS复合工程骨，以用量为(1‑2)mL/cm²的PBS缓冲液清洗2‑3次；此后将该SIS复合工程骨置于‑80℃/37℃反复冻融3‑5次，每次1h；之后再次以用量为(1‑2)mL/cm²的PBS缓冲液清洗2‑3次，进行去细胞化；将去细胞化后的复合工程骨置于‑80℃保存备用，此即为细胞组装小肠黏膜下层仿生复合工程骨。