一种利用桃胶凝胶板电泳完成古代丝织品测定的方法

摘要

本发明公开了一种利用桃胶凝胶电泳完成古代丝织品测定的方法，将古代丝织品经过脱胶，溶解，脱盐，透析，浓缩之后使用预先制备好的桃胶凝胶进行电泳实验，其中桃胶凝胶具有空间网状结构，经过一系列处理之后具有同琼脂糖凝胶的作用，且对环境无污染无公害，具有很的大利用价值。将古代丝织品电泳结果采用凝胶内酶切的方法酶解，然后使用HPLC‑MS/MS对其进行质谱分析，将结果与氨基酸序列数据库进行对比，根据氨基酸序列得到古代丝织品的材料类型；本发明采用蛋白质组学方法测定古代丝织品，一方面灵敏度高，操作简便；另一方面准确度高，样品使用量少。

主权项

一种利用桃胶凝胶板电泳完成古代丝织品测定的方法，其特征在于该方法采用步骤如下：a)将采摘的干燥桃胶固体20～50g溶胀在水中，重复过滤直到液体澄清，加入盐酸使其可以完全浸泡桃胶，控制水解温度80～100℃，水解时间0.5～1h，制得桃胶多糖；b)向桃胶液中加入质量分数为20～30％的H₂O₂溶液200～400ml对桃胶进行脱色处理，然后用截留分子量为3500～4000透析袋透析进行脱盐处理，透析24～30h后使用聚乙二醇6000进行浓缩，放入100～300ml质量分数为0.5～1.5％的SDS溶液中浸泡6～8h；c)在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板，制得桃胶凝胶板备电泳操作使用；d)称取一份古代丝织品，以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na₂CO₃水溶液和质量分数为0.5～1.5％的SDS混合溶液中沸煮30min进行脱胶，共脱胶两次，1h之后，将溶液和丝素分离，丝素用去离子水冲洗并在50～60℃的烘箱中烘干备用；e)将脱胶烘干的丝素纤维放入预先配好的CaCl₂:H₂O:ethanol为1:8:2的混合溶液中，浴比为1：25，加热到90～95℃蒸煮10～20min，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，并每隔3～4h换一次水，70～72h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/3～2/3；f)通过重泡涨上样法将步骤e)得到的样品用pH范围为3.0～5.3的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液2～3ml和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5ml平衡15～20min，进行桃胶凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像；g)将经步骤f)染色样品的电泳条带割下来分别装入1.5ml离心管中，加入300～400ul水震荡洗涤，重复一次后加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液40～70ul，2～4min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；h)向步骤g)所得的样品离心管中加入50～80ul的胰凝乳蛋白酶溶液，完全盖住胶粒冰浴40～50min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于25～35℃烘箱中孵育10～12h进行胶内酶解；i)采用HPLC‑MS/MS对其进行质谱分析，根据质谱检测得到的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比得到古代丝织品的蚕丝种类。