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一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)用手术工具取60‑80mg鱼脑组织，无菌RNase‑free水清洗后迅速放入液氮中速冻，‑80℃超低温冻存；2)将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase‑free EP管中，使用RNase‑free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8‑10s，间隔15‑20s，超声破碎8‑10s，17000‑19000g 4℃离心10min，取上清；其中，所述Trizol裂解液使用前加入β‑巯基乙醇和8‑羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0‑2.5％和0.10‑0.15％；3)加入500μl 4mol/L硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000‑7000g 4℃离心3‑5min，吸上清液至离心管B中；所述硫酸铵溶液的pH＝5.5；4)加入氯仿和正丁醇混合液350‑400μl，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4℃离心10min，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1；5)加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇‑醋酸钠混合液，振荡摇匀‑20℃放置60min；所述异丙醇‑醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋酸钠溶液的pH＝5.2；6)吸取步骤5)得到的混合液700μl至RNA纯化吸附柱中，12000g4℃离心1min，倒掉收集管中废液；7)向纯化吸附柱中加入500μl RNase‑free 75％的已预冷乙醇，静置1min，12000g 4℃离心1min，倒掉收集管中废液；重复一次；8)12000g 4℃离心2min，将吸附柱置于洁净RNase‑free离心管中，室温封闭静置5‑10min，晾干；9)向吸附柱中加入20‑22μL RNase‑free水，室温封闭静置2min，12000g 4℃离心1min，弃吸附柱；10)加入5μl的RNase‑free DNase缓冲液、2μl的RNase‑free DNA酶、1μl的RNA酶抑制剂和22μl RNase‑free水，37℃处理40‑50min，得到DNA酶处理液；11)加入2.5μl浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78‑82℃加热处理3min，随后依次加入RNase‑free水47.5μl、10μl浓度为3.5mol/L醋酸钠和250μl已预冷的无水乙醇，混匀后‑80℃放置15‑25min，12000g 4℃离心10min，弃上清；12)用75％已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4℃离心5min，弃上清，室温封闭静置5‑10min，晾干，加入RNase‑free水或0.5％的SDS溶液20‑30μl充分溶解，‑80℃保存。 |
