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一种酵素型基因芯片侦测试剂组，其特征在于，该试剂组包括基因芯片、和依次参与RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应及讯号侦测步骤所需试剂；其中，上述RNA萃取是：取200～500μl欲处理的血液检体与20～50μl蛋白酶溶液及200～500μl裂解溶液混合均匀，置于45～67℃反应8～12分钟后，加入20～50μl磁珠溶液与300～500μl结合溶液混合均匀，置于20～30℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液，于磁珠中加入700～1200μl清洗溶液混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除清洗后的溶液，并于磁珠中加入20～100μl溶解溶液混合均匀，接着再置于56～84℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠，收集所得溶液，即为RNA溶液；其中，蛋白酶溶液为蛋白酶K溶液；裂解溶液由4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠及聚乙二醇辛基苯基醚所组成；结合溶液由聚乙二醇及氯化钠所组成；清洗溶液由乙醇、丙三醇及醋酸铵所组成；溶解溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及乙二胺四乙酸所组成；上述cDNA合成是：将上述RNA溶液置于56～84℃反应8～12分钟后，加入1～5μl引子溶液混合均匀，并置于‑0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，接着加入5～10μl反转录溶液与1～5μl反转录酵素溶液混合均匀，置于34～50℃反应96～144分钟后，得到cDNA溶液；其中，引子溶液由寡核苷酸引子及随机引子所组成；反转录溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁及二硫代苏糖醇所组成；反转录酵素溶液由反转录酵素及核糖核酸酶抑制剂所组成；上述探针标志是：取10～50μl上述cDNA溶液置于76～114℃反应4～6分钟后，降温至‑0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，再加入1～5μl标志溶液混合均匀，置于34～50℃反应192～288分钟后，取得探针溶液；其中，标志溶液由随机引子、Klen Taq聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、生物素化脱氧三磷酸尿苷、Klen Taq缓冲液及丙三醇所组成；上述杂交反应是：将一基因芯片置入一反应盒，加入2～8ml杂交溶液混合均匀，置于34～50℃反应8～12分钟，另将上述探针溶液置于76～114℃反应4～6分钟后，降温至‑0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，再将此探针溶液加入该反应盒中，置于34～50℃反应384～576分钟后，取得探针反应溶液；其中，杂交溶液由聚乙二醇、十二基硫酸钠及氯化钠所组成；上述讯号侦测是：将上述探针反应溶液移除，留下基因芯片于反应盒中，于反应盒中加入2～8ml第一清洗溶液，清洗芯片4～6分钟后移除，重复两次，接着加入2～8ml第二清洗溶液，置于34～50℃清洗4～6分钟后移除，重复两次，加入2～8ml填补溶液，反应24～36分钟后移除，加入2～8ml抗体溶液，反应72～108分钟后移除，加入2～8ml第三清洗溶液，反应4～6分钟后移除，重复两次，最后加入2～8ml呈色溶液，置于34～50℃反应直到讯号产生，之后加入水清洗，直到讯号停止继续产生，烘干后即得到侦测结果；其中，填补溶液为阻断缓冲剂；上述基因芯片为尼龙膜或热塑性复合材料，该基因芯片选定寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列；该寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于10mM～200mM，序列长度介于40～60碱基，并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补关系。 |
