发明名称 |
一种成熟L‑谷氨酸氧化酶的生产方法 |
摘要 |
本发明公开了一种成熟L‑谷氨酸氧化酶的生产方法,首先构建含有L‑谷氨酸氧化酶基因和蛋白酶K基因的重组表达载体pPIC9K‑LGOX和pPICZα‑proteinase K,并依此转化至毕赤酵母GS115中并进行抗性筛选;挑取转化子并利用甲醇进行诱导表达,热处理后通过离心‑硫酸铵沉淀‑离心‑复溶步骤,获得所需的成熟LGOX,本发明利用重组毕赤酵母同时分泌表达LGOX和蛋白酶K,快速获得成熟LGOX,从而降低LGOX的生产成本,以满足α‑酮戊二酸的酶法生产及生物传感器固定化酶膜的制备。 |
申请公布号 |
CN106566841A |
申请公布日期 |
2017.04.19 |
申请号 |
CN201611193866.4 |
申请日期 |
2016.12.21 |
申请人 |
浙江海洋大学 |
发明人 |
唐云平;丁国芳;余方苗;杨最素;黄芳芳 |
分类号 |
C12N15/81(2006.01)I;C12N15/53(2006.01)I;C12N15/57(2006.01)I;C12N9/06(2006.01)I;C12N9/60(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/81(2006.01)I |
代理机构 |
杭州杭诚专利事务所有限公司 33109 |
代理人 |
尉伟敏;赵越剑 |
主权项 |
一种成熟L‑谷氨酸氧化酶的生产方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)构建含有L‑谷氨酸氧化酶基因和蛋白酶K基因的重组表达载体pPIC9K‑LGOX和pPICZα‑proteinase K;(2)将重组表达载体pPIC9K‑LGOX和pPICZα‑proteinase K用限制性内切酶线性化后,将重组表达载体pPIC9K‑LGOX转入到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过抗性筛选并结合酶活测定,获得能够高效表达LGOX的重组菌GS115‑LGOX;然后将pPICZα‑proteinase K转入到重组菌GS115‑LGOX中,通过抗性筛选并结合酶活测定,获得具有高效表达LGOX的重组菌GS115‑LGOX‑proteinase K;(3)重组菌GS115‑LGOX‑proteinase K使用诱导剂诱导表达重组蛋白,离心,收集上清液,经热处理,离心弃沉淀,上清液采用硫酸铵沉淀目的蛋白,离心,沉淀用缓冲液复溶,获得成熟LGOX。 |
地址 |
316022 浙江省舟山市定海区临城街道海大南路1号 |